肖 偉, 閆培生

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東威海 264209)

土壤是微生物的大本營,特別是在一些耕作土壤中由于含有各種植物的有機(jī)殘體及人工施入的大量有機(jī)堆肥，土壤中的有機(jī)質(zhì)十分豐富，利于土壤中微生物的生長與繁殖。土壤中的微生物種類與數(shù)量雖然眾多，但大多數(shù)都屬于中性微生物，這些微生物對植物并沒有明顯的益處或者危害；對植物有益和有害的微生物只占土壤微生物的很小部分，但這小部分微生物卻與植物病害特別是一些土傳病害的發(fā)生與流行密切相關(guān)。自然界中廣泛地存在抑菌型土壤(抑病型土壤)，一般認(rèn)為病原菌不能在這些土壤中定殖，或者能定殖但危害很小或沒有危害。抑菌型土壤一般可以分為普通抑菌土壤和特異抑菌土壤，普通抑菌土壤一般不具有轉(zhuǎn)移性，但特異抑菌土壤具有轉(zhuǎn)移性，可以通過一定的農(nóng)業(yè)措施來進(jìn)行培育[1-3]。

植物病害的生態(tài)防治是現(xiàn)代植物病害防治的發(fā)展趨勢。從植物病害的生態(tài)防治角度講， 植物病害的發(fā)生可以看成是植物所處的生態(tài)系統(tǒng)失衡所致，因此植物病害的生態(tài)防治就是生態(tài)系統(tǒng)平衡的重建，其防治觀點(diǎn)在于將病原微生種群的數(shù)量與危害性控制在允許的閾值之內(nèi)，從而確保植物生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展?？梢娭参锊『Φ纳鷳B(tài)防治是一個綜合系統(tǒng)的工程，其包括土壤微生態(tài)、作物栽培以及植物自身的抗病特性等方面的內(nèi)容[4-5]。

有機(jī)微生物菌肥是一種新型的肥料，其作為土壤添加劑可以改善土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物的生長，增強(qiáng)植物自身抗性與抗逆能力，提高農(nóng)作物的品質(zhì)與產(chǎn)量，所以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中使用有機(jī)微生物肥料已經(jīng)成為了植物病害生態(tài)防治的重要措施之一[6-8]。但在有機(jī)微生物菌肥，特別是在有機(jī)堆肥的使用過程中，有機(jī)質(zhì)本身對土壤微生物群落，尤其是對土壤中有益拮抗微生物群落的影響是一個特別值得關(guān)注的問題，即有機(jī)質(zhì)本身是否對土壤中的微生物有一定的選擇性促進(jìn)作用；較有害菌群而言，其是否更能促進(jìn)有益菌群的生長或者能選擇性地促進(jìn)所引入的有益微生物的生長[9]，即這些有機(jī)質(zhì)的施用是否有利于特異型抑菌土壤的培育。有機(jī)微生物菌肥的施用對土壤微生物的影響研究，主要集中在對微生物區(qū)系特征進(jìn)行研究，但由于土壤中的絕大多數(shù)微生物為中性微生物，所以對微生物區(qū)系特征的研究很難準(zhǔn)確地反映土壤的抑菌能力，很難對土壤的抑菌能力進(jìn)行宏觀的量化。土壤中微生物的代謝產(chǎn)物要作用于植物，首先這些物質(zhì)要溶于植物根際土壤的水中，因此土壤浸出液的抑菌活性能反映土壤本身的抑菌活性，所以測定土壤浸出液的抑菌活性，能從宏觀上量化土壤的抑菌能力。通過Tip-culture定量檢測法對土壤浸出液抑菌活性進(jìn)行檢測，可以容易地做到對土壤抑菌能力進(jìn)行很好的宏觀量化[10-11]。

海帶渣是加工海帶過程中主要固體廢棄物。海帶渣中的主要成分為海藻纖維、蛋白質(zhì)、海藻多糖、殼聚糖、多酚、甜菜堿等。作為海帶工業(yè)中最大宗的固體廢棄物，海帶渣傳統(tǒng)的主要處理方式是采取衛(wèi)生填埋，但這種方式不僅浪費(fèi)土壤資源，更浪費(fèi)了海帶渣中本身未被利用的有機(jī)質(zhì)成分，這不符合低碳發(fā)展的要求,所以圍繞海帶渣的資源化利用展開了廣泛的研究[12-16]。試驗(yàn)以海帶渣固體發(fā)酵微生物菌肥為研究對象，研究其作為土壤添加劑對土壤抑菌活性的影響，希望通過施用海帶渣固體發(fā)酵微生物菌肥能在一定程度上對特異抑菌土壤進(jìn)行培育，并希望以此作為植物病害生態(tài)防治的重要措施之一。

1 材料與方法

1.1 材料

海帶渣購于山東某海帶加工廠，制造生物肥采用的菌種為本實(shí)驗(yàn)室分離得到的一株枯草芽孢桿菌JGA2(-5)27-2，供試植物病原真菌為本實(shí)驗(yàn)室保存的一株寄生曲霉突變菌株，該突變菌株不能產(chǎn)生黃曲霉毒素，但能積累紅色的黃曲霉毒素合成的中間代謝產(chǎn)物。

1.2 海帶渣固體發(fā)酵微生物菌肥制備方法

生物菌母液制備：將試管斜面上的生防枯草芽孢桿菌JGA2(-5)27-2取一環(huán)接種到裝有20 mL GY培養(yǎng)液(含20 g/L葡萄糖和5 g/L酵母粉)的三角瓶中在搖床上培養(yǎng)12 h (35℃、150 rpm)，備用。

海帶渣固體發(fā)酵：將海帶渣進(jìn)行粉碎至0.5 mm，在培養(yǎng)瓶中裝38 g干海帶渣、 2 g蔗糖與60 mL去離子水，pH值為自然，滅菌。按照4%的接種量(4 mL)將制備好的生物菌母液接種到固體培養(yǎng)基中，在35℃進(jìn)行固體發(fā)酵8 d。發(fā)酵后海帶渣固體微生物菌肥中的有效活菌數(shù)為每克3.4×1010個。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 海帶渣固體發(fā)酵微生物菌肥抑菌活性試驗(yàn) 試驗(yàn)采用室內(nèi)培養(yǎng)方法。從農(nóng)場中取耕作土壤，用花盆裝土，每盆裝土700 g。在土壤中分別加入發(fā)酵后的海帶渣微生物菌肥10 g(F10)、 20 g(F20)、 40 g(F40)與未發(fā)酵的海帶渣基質(zhì)10 g (NF10)、 20 g(NF20)、 40 g(NF40)，以未添加海帶渣固體發(fā)酵微生物菌肥與未發(fā)酵的海帶渣基質(zhì)的處理組為對照2(CK2)，共7個處理，每個處理重復(fù)兩次。

在培養(yǎng)30、 60、 90 d后收集土壤浸出液。方法：晚上8點(diǎn)向各盆土壤中澆300 mL去離子水，過夜(12 h)。第二天早上8點(diǎn)收集托盤中的浸出液，將收集的浸出液進(jìn)行離心與微孔濾膜過濾，備用。

1.3.2 花生盆栽試驗(yàn) 試驗(yàn)采用盆栽方法，供試作物為花生。從農(nóng)場中取回耕作土壤700 g裝于花盆中，設(shè)施用20 g海帶渣固體發(fā)酵微生物菌肥與20 g未發(fā)酵的海帶渣基質(zhì)(60%含水量，未添加蔗糖)兩個處理，以未添加海帶渣固體發(fā)酵微生物菌肥與未發(fā)酵的海帶渣基質(zhì)的處理組為對照，每處理設(shè)3次重復(fù)。每個花盆中播5?；ㄉN；播種后70 d取土壤浸出液進(jìn)行抑菌活性的Tip-culture測定(圖1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶渣固體發(fā)酵微生物菌肥對土壤抑菌活性的影響

試驗(yàn)通過Tip-culture的培養(yǎng)方法對土壤浸出液抑制病原真菌寄生曲霉活性進(jìn)行定量檢測，檢測結(jié)果如表1。 試驗(yàn)結(jié)果表明, 施用海帶渣菌肥能顯著地提高土壤的抑菌活性，且在處理30 d后的測定值大于其他時期的測定值。這一現(xiàn)象的原因在于海帶渣固體發(fā)酵微生物菌肥本身具有較大的抑菌活性，同時其活性能較長時間穩(wěn)定地存在于土壤中。

在3次不同時間所取的樣本中，處理F20與處理F40的抑制病原真菌的活性均高于同一時期的其他處理，兩處理間差異不顯著。30 d后，處理F20與CK2、 NF10差異顯著，與CK1、 NF40差異極顯著；處理F40與CK2差異顯著，與CK1、 NF10、 NF40差異極顯著。60 d后，處理F20與CK2、 F10、 NF10、 NF20差異顯著，與CK1差異極顯著；F40與NF10差異顯著，與CK1差異極顯著。90 d后，處理F20與CK2、 F10、 NF10差異顯著，與CK1差異極顯著；處理F40與處理NF20差異顯著，與CK1、 CK2、 F10、 NF10差異極顯著。試驗(yàn)表明， 施用20 g或者40 g海帶渣菌肥均可有效抑制土壤病原真菌的活性。

表1 不同處理對土壤浸出液病原菌活性的抑制率(%)

2.2 花生盆栽驗(yàn)證試驗(yàn)

試驗(yàn)通過花生盆栽試驗(yàn)對施用海帶渣固體發(fā)酵微生物菌肥對土壤抑菌活性的影響做進(jìn)一步的驗(yàn)證(圖1)。播種70 d后， 取土壤浸出液進(jìn)行土壤抑制病原真菌寄生曲霉活性的Tip-culture測定，以此對海帶渣微生物菌肥能否提高土壤抑制病原真菌活性進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證?；ㄉ柙栽囼?yàn)也為海帶渣菌肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。Tip-culture培養(yǎng)結(jié)果如圖2，其菌絲的生長量(3個重復(fù)的平均值)： 未添加海帶渣菌肥和未發(fā)酵海帶渣的處理的Tip管中的寄生曲霉的生長量為(0.0215±0.0008) g，施用海帶渣菌肥處理的Tip管中的寄生曲霉的生長量為(0.0134±0.0009) g，施用未發(fā)酵海帶渣處理的Tip管中寄生曲霉的生長量為(0.0185±0.0014) g。以未施用海帶渣菌肥和未發(fā)酵海帶渣的處理為對照，進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)， 施用海帶渣菌肥的處理能極顯著地提高土壤抑制病原真菌的活性；施用海帶渣菌肥的處理與施用未發(fā)酵海帶渣基質(zhì)的處理差異極顯著。施用海帶渣菌肥處理的土壤的抑菌活性比對照提高了37.67%，而施用海帶渣處理組的土壤的抑菌活性比對照提高了13.95%。

圖1 花生盆栽驗(yàn)證試驗(yàn)Fig.1 Peanut pot validation test

圖2 花生盆栽驗(yàn)證試驗(yàn)土壤浸出液抑制病原真菌寄生曲霉活性的Tip-culture檢測Fig.2 Determination of the inhibitory activity of soil leachate against pathogenic fungi Aspergillus parasiticus by using the tip-culture method

利用SPSS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析采用比較均值單因素ANOVA。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明， 對照與海帶渣菌肥之間差異極顯著(P=0.000)；對照與未發(fā)酵海帶渣之間差異顯著(P=0.015)；海帶渣菌肥組與未發(fā)酵海帶渣組之間的差異極顯著(P=0.001)?；ㄉ柙则?yàn)證試驗(yàn)表明， 在栽種了花生的條件下施用海帶渣菌肥能極顯著提高土壤抑制病原真菌的活性，此研究為海帶渣菌肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

3 討論

土壤中絕大多數(shù)的微生物都屬于中性微生物，有益和有害微生物僅占較少一部分，但這小部分的有益和有害微生物卻與植物病害的發(fā)生與流行密切相關(guān)，特別是植物的土傳病害。向土壤中添加pH調(diào)節(jié)劑以及施用微生物菌肥或者有機(jī)堆肥是植物病害的生態(tài)防治的重要措施。施用石灰粉或者硫磺粉等來進(jìn)行土壤pH值的調(diào)節(jié)，使土壤的pH值不利于某一病害的發(fā)生，而有利于某一植物的生長，在這種此消彼長的綜合作用下提高植物的抗病性；施用微生物菌肥或者有機(jī)堆肥可以在一定程度上減少化肥的使用量，有利于調(diào)節(jié)土壤的理化性質(zhì)，有利于恢復(fù)土壤中微生物的數(shù)量與達(dá)到土壤中微生態(tài)的平衡，利用拮抗微生物減少病原物群體數(shù)量，有利于促進(jìn)植物的生長與提高植物的自身抗性。

本試驗(yàn)以海帶渣固體發(fā)酵微生物菌肥為土壤添加劑來處理土壤，并希望通過此方法引入特定的生防拮抗細(xì)菌來進(jìn)行特異抑菌土壤的培育。在研究過程中對土壤抑菌活性的量化往往缺少有效的手段，試驗(yàn)通過對土壤浸出液抑菌活性進(jìn)行Tip-culture的定量檢測，實(shí)現(xiàn)了土壤抑菌活性的量化。此手段簡單易行，便于在研究中使用。本研究同時為植物病害生態(tài)防治中有效土壤添加劑(微生物菌肥或者有機(jī)基質(zhì))的篩選提供了簡單易行的操作方法，并為海帶渣的資源化利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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