白志軍，曹毅敏，曹 慶，楊智聰，狄 飚

登革病毒(dengue virus, DENV)是流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)的一種蟲媒病毒，通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播。自然界存在的登革病毒有1、2、3、4血清型(DENV 1、DENV 2、DENV 3、DENV 4)， 可引起登革熱(dengue fever，DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome， DSS)等不同類型的急性傳染病[1-5]。 DENV為單股正鏈RNA病毒，E基因是病毒的主要包膜蛋白，E蛋白在病毒與宿主細(xì)胞相互作用過程中發(fā)揮著重要的功能，E基因也常用于病毒基因進(jìn)化分析研究中[6-7]。

本文對(duì)2012年廣州地區(qū)分離獲得DENV 1、DENV 2型8株，RT-PCR擴(kuò)增毒株的E基因，同時(shí)針對(duì)E基因序列，與基因庫中已經(jīng)公布的序列進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化分析，以期了解其序列特征與可能的傳播來源。

1 材料與方法

1.1試劑 RNA 提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司、一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物科技有限公司。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成 參照方美玉等[8]設(shè)計(jì)的序列合成DENV 1、DENV 2特異性引物；參考DENV l新加坡S275/90(GenBank登錄號(hào)：M87512)株基因組序列，DENV 2牙買加1409(GenBank登錄號(hào)：M20558)株基因組序列，用Premier Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)合成DENV 1和DENV 2的E基因擴(kuò)增引物。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3病毒培養(yǎng)及RNA提取 收集478例2012年廣州市登革病毒抗體監(jiān)測(cè)陽性患者的急性期血清，用RPMI 1640培養(yǎng)基1∶10 稀釋后，取100 μL接種到25 cm2細(xì)胞瓶培養(yǎng)的單層C6/36白蚊伊蚊傳代細(xì)胞中, 吸附2 h后棄上清液，加入含體積分?jǐn)?shù)為0.1的小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，29 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后傳代，連續(xù)傳代3次，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液140 μL，用RNA 提取試劑盒提取RNA。以出現(xiàn)細(xì)胞病變，或細(xì)胞培養(yǎng)上清液經(jīng)登革特異性引物PCR擴(kuò)增，有擴(kuò)增產(chǎn)物者則判斷為陽性，連續(xù)傳代3次均無細(xì)胞病變且經(jīng)過登革特異性引物PCR擴(kuò)增，無擴(kuò)增產(chǎn)物者，則判斷為陰性。

1.4RT-PCR擴(kuò)增 用一步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)條件，50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。用Tris-硼酸(TBE)緩沖液配制含0.5 mg/L溴化乙錠的質(zhì)量濃度為0.015 kg/L的瓊脂糖凝膠，取5 μL PCR產(chǎn)物，與1 μL上樣緩沖液混和，在TBE緩沖液中以80伏恒壓電泳30 min，在透射紫外分析儀上觀察，以出現(xiàn)相應(yīng)的特異性條帶為陽性結(jié)果，用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收。

1.5序列測(cè)定和拼接 純化后的PCR產(chǎn)物由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)定后的各片段序列采用Seqman程序( DNAstar 分析軟件之一)進(jìn)行拼接并組裝成完整的E基因序列，經(jīng)過核對(duì)校正后上傳至GenBank。

1.6基因序列的同源性和進(jìn)化分析 應(yīng)用MegAlign程序( DNAstar分析軟件之一)將分離的2012年廣州DENV 1、DENV 2流行株E基因序列與GenBank中我國(guó)近30年來本土流行DENV 1和DENV 2的毒株進(jìn)行序列堿基和氨基酸的同源性比對(duì)；應(yīng)用DANMAN version 6基因分析軟件，將以上流行株序列與其他作為參考的各亞型病毒株E基因(均源自GenBank)進(jìn)行序列多重比對(duì)(multiple alignment)，采用Kimura校正模型的領(lǐng)接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.1C6/36細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒 478份血清標(biāo)本，用C6/36細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，其中49份標(biāo)本均出現(xiàn)細(xì)胞聚堆等細(xì)胞病變現(xiàn)象，見圖1。

圖1C6/36細(xì)胞病變鑒定(100×)

Fig.1IdentificationofC6/36cellcytopathiceffect(Originalmagnification:100×)

2.2登革病毒E基因的RT-PCR擴(kuò)增 細(xì)胞病變陽性的培養(yǎng)上清液，提取病毒RNA，用DENV 1、DENV 2型特異性引物進(jìn)行RT-PCR， 8份培養(yǎng)上清液可擴(kuò)增特異性產(chǎn)物。繼以擴(kuò)增E基因，發(fā)現(xiàn)8份培養(yǎng)上清液均可擴(kuò)增出特異性的產(chǎn)物，各片段長(zhǎng)度均與預(yù)期相符，對(duì)E基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收供測(cè)序使用。8株病毒感染病例資料見表2。

2.3序列測(cè)定、基因特征 所有片段經(jīng)雙向測(cè)序反應(yīng)均可獲得一致的堿基序列，應(yīng)用Seqman程序進(jìn)行拼接并組裝成完整的E基因序列。6株DENV 1和2株DENV 2的E基因均由1485個(gè)堿基組成，編碼495個(gè)氨基酸，序列經(jīng)分析均已上傳至GenBank。

2.4E基因序列的同源性分析 DENV 1和DENV 2堿基(氨基酸)序列同源性分別為90.2%～99.9%(95.8%～100.0%)和91.3%～99.5%(95.4%～99.8%)，見表3，4。

表1 DENV 1和DENV 2PCR引物序列

Note: * T letters for DENV 1 and DENV 2 virus specific primers in primers; E letters for the primer of E gene; F letters for the forward primer; R letters for the reverse primer.

表2 8株DEN感染病例流行病學(xué)資料

2012年的6株DENV 1E基因堿基或氨基酸分析顯示，其中12/GZ/3297(D1-3297)、12/GZ/8309(D1-8309)和12/GZ/13795(D1-13795)毒株氨基酸序列同源性較高99.8～100.0%；12/GZ/14480(D1-14480)、12/GZ/15453(D1-15453)和12/GZ/15556(D1-15556)堿基序列同源性較高均為99.9%。我們將國(guó)內(nèi)近30年來9次不同年份的DENV 1流行分離株與2012年6株DENV 1的E基因進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示2012年所有DENV 1與2011、2006和2004年份的11/GZ/03、GZ061707、FJ231/04、ZJ 01/2004等4株國(guó)內(nèi)流行株氨基酸序列同源性較高在98.8%～99.8%之間，尤其與2006年的GZ061707氨基酸同源性最高分別為99.8%、99.6%、99.8%、99.8%、99.8%、99.6%，而與其他年份國(guó)內(nèi)流行株氨基酸相對(duì)較低在96.2%～98.4%之間。

我們將國(guó)內(nèi)近30年來9次不同年份的DENV 2流行分離株與2012年2株DENV 2，即12/GZ/12851(D2-12851)和12/GZ/15145(D2-15145)的E基因進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示2012年的2株DENV 2與國(guó)內(nèi)流行株之間堿基(氨基酸)同源性均相對(duì)較低在91.3%～96.8%(96.2%～98.8%)之間。

2.5基因序列的進(jìn)化分析 參照Rico-Hesse等[9]基因分型原則。本研究中的6株DENV 1均在同一基因型，即亞洲型，系統(tǒng)發(fā)育樹觀察D1-3297、D1-8309和D1-137953株與2011年廣州分離的柬埔寨輸入病例毒株11/GZ/02進(jìn)化距離最近，堿基同源性均在99.8%以上，尤其D1-3297與11/GZ/02完全一致無差異，堿基完全相同。D1-14480、D1-15453和D1-15556則與我國(guó)福建2004年流行株FJ231/04進(jìn)化距離較近，堿基同源性分別為98.7%、98.8%和98.7%。

表3 廣州DENV 1 E基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸的同源性比較(%)

Note: Base (lower left) and the deduced amino acids (upper right).

11/GZ/03 (Guangzhou, China, 2011); GZ061707 (Guangzhou,China,2006);

FJ231/04(Fujian, China, 2004); ZJ01/2004 (Zhejiang, China, 2004);

GZ/218/2002 (Guangzhou, China, 2002); GD99/99 (Chaozhou, China, 1999);

GD01/97 (Chaozhou, China, 1997); GD95/95 (Zhongshan, China,1995);

GD03/91 (Guangzhou, China, 1991); GZ/80 (Guangzhou, China, 1980).

表4 廣州DENV 1 E基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸的同源性比較(%)

Note: Base (lower left) and the deduced amino acids (upper right).

10/GZ/11864 (Guangzhou, China, 2010); 1008DHF (Taiwan, China, 2004);

GD19/2001 (Jiangmeng, China, 2001); FJ-10 (Fujian, China, 2000);

GD05/98(Nanhai, China, 1998); GD09/93 (Fushan, China, 1993);

44 (Hainan, China, 1989); 43 (Guangxi, China, 1987); 04 (Hainan, China, 1985)

2株DENV 2屬于兩個(gè)不同的亞型， D2-12851屬于馬來西亞/印度次大陸型， D2-15145屬于東南亞型(見圖3)，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示D2-12851與2010年新加坡分離株SG(EHI)D2/34820Y10，D2-15145與2006年臺(tái)灣分離株0606aTw進(jìn)化距離較近，堿基同源性分別為99.5%和99.3%。

3 討 論

廣州市地處亞熱帶，年平均氣溫高，降雨量大，氣候條件適合登革熱傳播媒介白蚊伊蚊的生長(zhǎng)，利于登革熱疫情的發(fā)生。廣州市自1978 年以來曾發(fā)生9次登革熱流行，并且登革病毒1～4四個(gè)血清型都曾有過流行。其中1995、2002、2006和2011年是DENV 1型，1985、1986和1988年是DENV 2型[8,10-11]。2012年廣州市疾病預(yù)防控制中心在廣州地區(qū)登革病毒抗體全年監(jiān)測(cè)中篩出IgM/IgG抗體陽性患者478例，其血清經(jīng)C6/36細(xì)胞分離培養(yǎng)獲得49株病毒， PCR鑒定并測(cè)序，同年中DENV 1～4型均存在，發(fā)現(xiàn)其中6例是DENV 1型，2例是DENV 2型，15例DENV 3，26例DENV 4，DENV 3和DENV 4我們已經(jīng)做過相關(guān)分析[12-13]， 本研究我們針對(duì)DENV 1和DENV 2型E基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)的分析。

Rico-Hesse等[9]利用全序列的DENV 1、DENV 2型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確認(rèn)了登革病毒血清型亞型的存在，并將登革病毒基因型明確定義為“一類基因序列差異不超過6%的登革病毒” 堿基序列差異小于6%為高同源，反之低同源。按照地理分布分別命名為，DENV 1有森林/馬來西亞型、美洲/非洲型、南太平洋型、亞洲型和泰國(guó)型；DENV 2有森林/西非型、美洲型、馬來西亞/印度次大陸型、東南亞型。

8株登革病毒E基因序列未見序列插入或缺失。將這些DENV中的DENV 1、DENV 2，分別與GenBank中我國(guó)近30年來本土流行的10株DENV 1和9株DENV 2進(jìn)行E基因序列堿基和氨基酸的同源性比對(duì)(見表3和4)，與GenBank中多株全球不同地區(qū)的DENV 1型和DENV 2E基因代表序列繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2和3)，目的以探索其可能的來源以及是否存在本土隔年傳播的可能。

6株DENV 1的數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明D1-3297、D1-8309、D1-13795、D1-14480、D1-15453和D1-15556均屬于亞洲型。經(jīng)病例資料分析，D1-3297、D1-8309和D1-13795在發(fā)病前均有境外活動(dòng)史，且患者進(jìn)入廣州后發(fā)病，D1-13795可確定其是柬埔寨輸入，尚不能確定D1-3297和D1-8309來源于境外何處，但通過E基因同源分析和系統(tǒng)發(fā)育樹中可發(fā)現(xiàn)，這3株與2011年我們?cè)趶V州人群分離的DENV 1柬埔寨輸入株11/GZ/02高度同源且進(jìn)化距離相當(dāng)接近， 3株DENV 1在流行過程中，病毒的E基因核酸序列發(fā)生了一定程度的突變，但這些突變絕大部分是“同義突變”，即不影響其編碼的氨基酸序列，因此可以推測(cè)它們均為同一來源的柬埔寨流行株。

而D1-14480、D1-15453和D1-15556均為佛山居民，來廣州區(qū)域活動(dòng)時(shí)發(fā)病而被監(jiān)測(cè)，3株病毒E基因堿基同源性均為99.9%。同樣，它們的堿基突變部分是“同義突變”。據(jù)報(bào)道在2012年6月以來佛山人群暴發(fā)登革熱疫情[14]，廣州與佛山地理位置鄰近，因此可以判斷此3株病毒是同一來源的2012年佛山流行株。以上6株DENV 1與以往本土流行株傳播鏈不存在直接的關(guān)系，均為輸入性毒株。

2株DENV 2數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明D2-12851和D2-15145分別屬于馬來西亞/印度次大陸型和東南亞型?；蛲葱苑治?，此2株病毒與我國(guó)的DENV 2流行株差異較大，沒有發(fā)現(xiàn)它們之間屬同一毒株進(jìn)化而來。經(jīng)病例資料分析，他們發(fā)病前分別來自孟加拉國(guó)和緬甸，同樣，這兩株DENV 2與以往本土流行株傳播鏈也不存在直接的關(guān)系，可推斷病毒均為境外輸入株。

早在20世紀(jì)70年代，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)異型登革病毒二次感染會(huì)造成抗體依賴性感染增強(qiáng)作用(ADE)，從而易引發(fā)登革出血熱，進(jìn)而提出了抗體依賴性感染增強(qiáng)學(xué)說[11，15-16]。經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查2012年廣州地區(qū)記錄的登革熱病例均未曾有登革熱感染史，目前廣州地區(qū)還未有DHF和DSS的報(bào)道，ADE現(xiàn)象還不明確。但隨著近年登革熱在廣州呈現(xiàn)同年不同型別、不同型別不同年交替流行的狀態(tài)，且2010[17-18]和2012年DENV 1～4型均出現(xiàn)在廣州，讓我們一直擔(dān)心廣州人群中是否也將會(huì)出現(xiàn)重癥的DHF和DSS，這提醒廣州防疫部門及時(shí)發(fā)現(xiàn)和控制傳染源，以防登革熱重癥病例的出現(xiàn)。

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