秦 茜，谷 禾，梁韶暉，韓真真，鄭善子

棘阿米巴(Acanthamoeba)是棘阿米巴角膜炎和阿米巴性肉芽腫性腦炎的病原體，目前報(bào)告能夠引起人類(lèi)致病的至少有27種[1]，其中有10種能引起人或動(dòng)物機(jī)會(huì)性致病。自1973年Jones等報(bào)道了世界上首例棘阿米巴性角膜炎病例[2]以后，1992年金秀英等報(bào)告我國(guó)首例棘阿米巴性角膜炎病[3]。棘阿米巴角膜炎(Acanthamoeba keratitis，AK)是一種致盲率極高，頑固性、進(jìn)行性角膜炎。近20年來(lái)，AK發(fā)病率的升高與隱形眼鏡(Contact lens，CL)及軟性角膜接觸鏡(Soft contact lens，SCL)用于糾正視力的治療及普及密切相關(guān)。1994～2012年全國(guó)棘阿米巴207例病例報(bào)道中[4-22]發(fā)現(xiàn)，因佩戴隱形眼鏡導(dǎo)致的AK占12%～78%[4-6,11,13,16]。棘阿米巴角膜炎發(fā)病早期常缺乏特異性臨床表現(xiàn)，常因漏診、誤診而延誤治療引起致盲，故其診斷和治療仍然是棘手的問(wèn)題。診斷技術(shù)，尤其是早期診斷技術(shù)的研究及應(yīng)用對(duì)于阻止棘阿米巴感染人眼引起角膜致盲起著舉足輕重的作用。本研究在課題組研究基礎(chǔ)上[23-24]進(jìn)一步研究建立了無(wú)創(chuàng)，更為經(jīng)濟(jì)適用，靈敏度高的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR，又縮寫(xiě)為qPCR)基因檢測(cè)法測(cè)定棘阿米巴的18sDNA，并運(yùn)用建立的方法對(duì)臨床疑似樣本進(jìn)行檢測(cè)，為臨床無(wú)創(chuàng)性早期診斷該病原奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1樣本及基因測(cè)序 4株土壤中分離的棘阿米巴CB/S1(T5型)，CG/S1(T4型)，CJY/S1(T4型)

CJY/S2(T4型)和1株水中分離的棘阿米巴CJY/S2(T4型)樣本及基因測(cè)序由延邊大學(xué)提供，根據(jù)鄭善子等[25]建立的分離及培養(yǎng)棘阿米巴的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行保種和傳代。同時(shí)選用溫州醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供的大腸桿菌，人巨細(xì)胞病毒和寄生蟲(chóng)學(xué)教研室提供的卡式肺孢子蟲(chóng)以及根據(jù)朱學(xué)軍[26]等報(bào)道由本科組建立的兔棘阿米巴角膜炎模型眼分泌物和由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬二院眼科、附屬眼視光醫(yī)院提供的疑似病人眼分泌物160例，作為對(duì)照樣品及方法應(yīng)用驗(yàn)證。用傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室蟲(chóng)株培養(yǎng)法對(duì)病例樣本培養(yǎng)作為qPCR檢測(cè)方法對(duì)照。

1．2DNA提取 取培養(yǎng)液標(biāo)本500 μL，12 000 r/min離心10 min, 棄上清，在沉淀中加入50 μL抽提裂解液混勻(10 mmol/L Tri-HCl，pH 7.6, 5 mmol/L EDTA， 0.5%SDS)置100 ℃煮沸10 min, 12 000 r/min離心5 min，取2 μL上清液作為PCR模板。

1．3qPCR反應(yīng) 運(yùn)用Bio edit軟件對(duì)測(cè)序樣本進(jìn)行基因比對(duì)后，在棘阿米巴物種保守序列區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針序列(上海生工合成)。引物序列為Forward: 5′-TATGGTCGCAAGGCTGAAACT-3′，Reverse：5′-GAGCTATCAATCTGTCAATCCT-3′。探針序列為5′FAM-ACCTGGTAAGTTTCCCCGTGTTG-BHQ1-3′。qPCR反應(yīng)體系25 μL，各引物和探針濃度分別為0.4 μmol/L和0.2 μmol/L，TaqMan探針需要高效液相 (HPLC)純化，反應(yīng)體系包括2×熒光定量PCR 緩沖液(其中包括dNTP、MgCl2和熱啟動(dòng)Taq酶等)12.5 μL，引物0.25 μL，探針0.1 μL，模板2 μL。qPCR反應(yīng)體系由大連寶生物工程有限公司提供(TAKARA)。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min后，94 ℃ 15 s，62 ℃ 60 s為一個(gè)循環(huán)，共循環(huán)40次(ABI 7500檢測(cè)儀上檢測(cè))。每份樣本重復(fù)檢測(cè)3次篩選出重復(fù)穩(wěn)定性強(qiáng)的棘阿米巴株由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司(Invirogen)構(gòu)建T載體克隆陽(yáng)性質(zhì)粒，并測(cè)序。以該棘阿米巴菌株原液和稀釋10倍、102倍、103倍樣本建立qPCR檢測(cè)棘阿米巴標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．4數(shù)據(jù)分析 分別運(yùn)用JMP5.0.1中F檢驗(yàn)方差分析和診斷測(cè)試評(píng)估軟件評(píng)估160疑似棘阿米巴角膜炎病例陽(yáng)性感染率和比較qPCR檢測(cè)法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法95%置信區(qū)間內(nèi)靈敏度和特異性。用30例正常人眼分泌物，家兔棘阿米巴模型眼分泌物，5株實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)不同基因型棘阿米巴及其他病原微生物作為對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法和qPCR法測(cè)定棘阿米巴樣本結(jié)果 兩種方法測(cè)定棘阿米巴角膜炎疑似病例結(jié)果見(jiàn)表1,測(cè)定的CT值22.01，160例疑似棘阿米巴角膜炎病人眼分泌物中，用培養(yǎng)法測(cè)出5例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為3.31%，其中3例有佩戴隱形眼鏡。用qPCR法測(cè)出6例陽(yáng)性，包含培養(yǎng)法測(cè)定的5例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為3.75%，見(jiàn)表2，其中有4例患者佩戴隱形眼鏡。用Jmp5.0.1分析軟件F方差分析比較培養(yǎng)法陽(yáng)性率(3.13%)和 qPCR法測(cè)定陽(yáng)性率(3.75%)，其F= 0.6189,P=0.4614>0.05, 故沒(méi)有明顯差別。正常人眼分泌物30例、大腸桿菌、人巨細(xì)胞病毒和卡式肺孢子蟲(chóng)，用qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)株、兔棘阿米巴模型眼分泌物沒(méi)有交叉反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。qPCR測(cè)定棘阿米巴陽(yáng)性結(jié)果與陰性結(jié)果分別見(jiàn)圖1,2。根據(jù)樣本分子量=堿基數(shù)×324，待測(cè)樣本拷貝數(shù)(copies/μL)=待測(cè)樣本濃度/樣本分子量×6×1014計(jì)算公式，經(jīng)過(guò)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在10拷貝/mL時(shí)的重復(fù)性為100%，而低于10拷貝之后，檢測(cè)的重復(fù)性不是太穩(wěn)定，所以定10拷貝/mL為最低檢測(cè)濃度。

2.2qPCR測(cè)定棘阿米巴標(biāo)準(zhǔn)曲線 用qPCR測(cè)定棘阿米巴四種稀釋濃度結(jié)果見(jiàn)圖3，T載體克隆陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序后BLAST得知該菌株為為T(mén)4型，約130 bp擴(kuò)增片段。以該4個(gè)濃度滴度作為檢驗(yàn)該熒光定量PCR的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)該4個(gè)濃度的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線CT值與濃度對(duì)數(shù)成線性關(guān)系，因此我們以CT值為縱坐標(biāo)(Y)，以樣本濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)圖4：Y=-3.24 X+40.74，R>0.99。

圖1 qPCR測(cè)定棘阿米巴陽(yáng)性結(jié)果

圖2 qPCR測(cè)定棘阿米巴陰性結(jié)果

樣 本Sample數(shù)量No.培養(yǎng) Culture陽(yáng)性陰性PosNegqPCR陽(yáng)性陰性PosNeg溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光醫(yī)院疑似病例Sample 180278278溫州醫(yī)科大學(xué)附屬二院眼科疑似病例Sample 280377476正常人眼分泌物Normal30030030樣 本Sample數(shù)量No.培養(yǎng)檢測(cè) Culture陽(yáng)性陰性PosNegqPCR陽(yáng)性陰性PosNeg實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)株Culture in Lab55050家兔動(dòng)物模型眼分泌物Animal model eye secession33030大腸桿菌、人巨細(xì)胞病毒和卡式肺孢子蟲(chóng)Other pathogen30303

圖3棘米巴原液和稀釋101倍、102倍、103倍樣本qPCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.3ResultsofqPCRtestsampleanddiluteto101,102,and103samples

2.3qPCR法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法測(cè)定比較 用診斷測(cè)試評(píng)估軟件測(cè)定表1中兩種方法顯示檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)后得出兩種方法的陽(yáng)性率，靈敏度，特異性，陽(yáng)性預(yù)先值和陰性預(yù)測(cè)值見(jiàn)表2。培養(yǎng)法靈敏度為83.33%,95%置信區(qū)間為36.10%～97.24%，特異性為100%，95%置信區(qū)間為99.61%～100%，陽(yáng)性預(yù)先值為100，95%置信區(qū)間為47.95%～100%。qPCR法靈敏度為100,95%置信區(qū)間為47.95%～100%，特異性為99.35，95%置信區(qū)間為96.44%～99.89%，陽(yáng)性預(yù)先值為83.33%，95%置信區(qū)間為36.10%～97.24%。

圖4用棘米巴原液和稀釋10倍、102倍、103倍樣本建立qPCR測(cè)定棘阿米巴標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

Fig.4StandardcurvesofestablishedqPCRmethodtestsampleand101,102,and103samples

表2PCR法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)160例棘阿米巴角膜炎疑似病例靈敏度及特異性的比較

Tab.2ComparisonofsensibilityandspecificityforcultureandqPCRmethodinthediagnosisofsuspectedAcanthamoebakeratitiscases

檢測(cè)方法(Method)陽(yáng)性(Pos)陽(yáng)性率%(Posrate %)培養(yǎng)(+)QPCR(-)C PosQPCR Neg培養(yǎng)(-)QPCR(+)C NegQPCR Pos培養(yǎng)(-)QPCR(-)C NegQPCR Pos靈敏度%Sensitivity%特異性%Specificity%陽(yáng)性的預(yù)先值%PPV%陰性的預(yù)先值%NPV%培養(yǎng)Culture53.13qPCR63.75?0130983.33(36.10～97.24)100(99.61～100)100(47.95～100)99.35(96.44～99.89)100(47.95～100)99.35(96.44～99.89)83.33(36.10～97.24)100(97.61～100)

注: F檢驗(yàn)方差分析兩種方法檢測(cè)棘阿米巴角膜炎疑似病例陽(yáng)性率比較結(jié)果F=0.6189,P=0.4614>0.05, 故沒(méi)有明顯差別。

診斷測(cè)試評(píng)估兩種方法的靈敏度與特異性測(cè)定均在95%置信區(qū)間內(nèi)。

Note: Pos=Positive; Neg=Negative; PPV=Positive predictive value; NPV=Negative predictive value.

F=0.6189,P=0.4614>0.05, which is no significant difference (95% CI).

3 討 論

棘阿米巴角膜炎是致盲率極高的慢性進(jìn)行性角膜炎。棘阿米巴的繁殖速度極快，感染包囊3 d內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)樽甜B(yǎng)體，且包囊不易被殺滅，故該病治療預(yù)后極差。AK患者在早期多以單眼畏光、流淚和疼痛為主訴，常缺乏特異性，國(guó)內(nèi)缺乏早期高效、靈敏的診斷技術(shù)的研究、推廣和應(yīng)用，因此常導(dǎo)致誤診、漏診、誤治。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，無(wú)創(chuàng)傷性、靈敏度高、特異性強(qiáng)的 PCR技術(shù)逐漸取代了角膜刮片中尋找病原檢查。本課題組經(jīng)過(guò)近7年研究，致力尋找經(jīng)濟(jì)適用，高效靈敏的早期診斷技術(shù)，本文通過(guò)對(duì)臨床疑似病例檢測(cè)比較，Real-time PCR又名為qPCR技術(shù)靈敏度(100)高于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)(靈敏度為83.33)。經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證，該方法檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性高，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中也可看出不同稀釋濃度樣品相關(guān)性較好，R值達(dá)到0.99以上，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中得知qPCR測(cè)定棘阿米巴CT值與樣本濃度的對(duì)數(shù)成反比，樣品10拷貝/mL為最低檢測(cè)濃度。通過(guò)qPCR技術(shù)對(duì)正常眼分泌物、細(xì)菌、病毒、其他寄生蟲(chóng)與實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)株、動(dòng)物模型檢測(cè)比較，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的特異性和準(zhǔn)確性。qPCR技術(shù)應(yīng)用在檢測(cè)棘阿米巴角膜炎上具有無(wú)創(chuàng)，經(jīng)濟(jì)，高效，靈敏，準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

引起AK的病因有很多，但從已有的報(bào)道來(lái)看，多數(shù)與隱形眼鏡及軟性角膜接觸鏡矯正屈光不正在我國(guó)的普遍使用有密切關(guān)系。棘阿米巴的病例由20年前的10余發(fā)展到現(xiàn)在的207例，其中因CL和SCL引起的病例國(guó)內(nèi)達(dá)到45%[4-6,11,13,16]，國(guó)外從30%～40%上升到現(xiàn)在的70%左右。根據(jù)18s rDNA(Rns)基因分型結(jié)果，感染人類(lèi)角膜的棘阿米巴多屬于Rns T4型，少數(shù)屬于Rns T3和T6型。此外，污染的隱形眼鏡護(hù)理液，泥土，臟水，外傷及手術(shù)后感染等也是引發(fā)感染的因素，其中僅次與角膜接觸鏡的原因主要為外傷(10%～40%)[6,11,16]引起的感染。

與其他PCR檢測(cè)技術(shù)相比，qPCR技術(shù)比起RT-PCR技術(shù)更為經(jīng)濟(jì)適用，因?yàn)樗梢圆恍枰孓D(zhuǎn)錄，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。比普通PCR更直觀看出感染濃度，比復(fù)合PCR更穩(wěn)定，重復(fù)性更高。

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