許 進，汪世平，周云飛，金 晶，彭交鳳，尹鐵球，何 鑫，李 芬,何 軍，徐紹銳

血吸蟲病在世界范圍廣泛流行，仍是一種嚴(yán)重危害流行區(qū)居民身心健康、阻礙社會經(jīng)濟發(fā)展的人獸共患寄生蟲病[1]。我國經(jīng)過幾十年的防治取得了舉世矚目的成就。目前，急感疫情主要局限于湖北、湖南、安徽、江西等4省湖區(qū)，并處于較低流行態(tài)勢。但是，常規(guī)糞檢查病方法的不夠敏感。2011年全國居民血吸蟲感染時其中93%(54 679/58 840)用免疫學(xué)診斷技術(shù)，僅有7%(4 161/58 840)用病原學(xué)診斷方法[2]，顯示免疫學(xué)診斷技術(shù)在現(xiàn)場應(yīng)用中扮演非常重要角色。然而，現(xiàn)階段市場上診斷抗原大多為蟲源或卵源性的粗制混合抗原，由于抗原制備難以標(biāo)化、批間差異大，在現(xiàn)場應(yīng)用中存在難以克服的技術(shù)瓶頸，使其大規(guī)?，F(xiàn)場應(yīng)用受到了限制。近幾年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，蛋白重組技術(shù)使得低成本獲得高純度的單一組分的血吸蟲重組抗原成為可能。

業(yè)已證明[3-5]，SjSDISP具有較強的免疫原性和免疫反應(yīng)特性。本文通過構(gòu)建SjSDISP原核表達質(zhì)粒，通過誘導(dǎo)表達和純化，獲得較純的rSjSDISP重組蛋白抗原。以rSjSDISP為診斷抗原建立F-ELISA體系，并對其作出評價；同時與SEA-IHA、SEA-F-ELISA平行檢測335份血吸蟲病疫區(qū)現(xiàn)場人血清，比較分析三者的敏感度與特異度，以期為日本血吸蟲琥珀酸脫氫酶鐵硫蛋白作為診斷血吸蟲病的重組抗原提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 酵母提取物(YEAST EXTRACT)、胰蛋白胨(TRYPTONE)為英國OXOID公司生產(chǎn)；瓊脂糖(Agarose)為西班牙進口分裝(上海Dene Tech公司)產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ，SalⅠ)、DNAMaker、Protien Maker均為Ferments公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒(DP103-02)、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(DP204-02)為天根生物技術(shù)公司產(chǎn)品；日本血吸蟲抗體檢測試劑盒(間接血凝法)為岳陽迅超生物科技有限公司產(chǎn)品；日本血吸蟲病快速診斷試劑盒為湘雅醫(yī)學(xué)院血吸蟲病研究室研制，湖南景達生物工程有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2實驗動物 陽性釘螺為本系釘螺實驗基地提供；SPF級新西蘭大白兔，雌性，體重1.5 kg～2.5 kg，購自湖南省農(nóng)業(yè)大學(xué)動物中心。

1.1.3菌株 菌株E.coliBL21、pET32a(+)、pQE30/SjSDISP為本科室保存菌種。

1.1.4血清 335份現(xiàn)場血吸蟲病流行區(qū)人血清為本科室所保存，30份健康人血清、18份血吸蟲病患者血清(糞便中查到蟲卵確診)、9份衛(wèi)氏并殖吸蟲患者血清(糞便中查到蟲卵確診)、4份肝片吸蟲患者血清(糞便中查到蟲卵確診)由本系特檢室提供。

1.2方法

1.2.1pET32a/SjSDISP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達

1.2.1.1SjSDISP成熟體基因的PCR擴增 依據(jù)SjSDISP目的基因序列和原核表達載體pET32a(+)多克隆酶切位點，設(shè)計引物一對(由上海華大基因有限公司合成)。

上游引物P1為：5′-GCGGATCCATGCTGAAGTCTCTATCTAC-3′

BamHⅠ

下游引物F1為：5′-ACGTCGACTCAGTCAGTTCTTGTCTCCG-3′

SalⅠ

以重組質(zhì)粒pQE30/SjSDISP為模板進行PCR擴增。擴增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸130 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.2.1.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物，純化回收目的片段，亞克隆至載體pET32a (+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a/SjSDISP，轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。將陽性單克隆菌液按照快速小量質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒，進行BamHΙ、SalΙ雙酶切鑒定和DNA測序鑒定(由武漢華大基因有限公司完成測序)。

1.2.1.3pET32a/SjSDISP重組質(zhì)粒表達條件的優(yōu)化 遵循單因子變量原則通過對溫度、誘導(dǎo)時間、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)終濃度進行一系列的條件模擬，最后用12%SDS-PAGE確定最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.1.4重組表達產(chǎn)物的純化 取菌體裂解上清液，用0.45 μm過濾器過濾。按Ni2+-NTA親和層析柱說明書過柱純化上清過濾液，分別進行洗滌和洗脫，分組收集洗滌液和洗脫液，最后用12%SDS-PAGE凝膠電泳，觀察純化結(jié)果。

1.2.1.5純化rSjSDISP重組蛋白抗原的免疫原性鑒定 按照文獻[6]報道的方法對rSjSDISP重組抗原進行Western blot免疫原性鑒定。取純化的rSjSDISP分別與PBS 、1∶2 000的小鼠His-tag 抗體及1∶20的鼠陽性血清、鼠陰性血清反應(yīng)，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠、兔抗體為二抗，進行Western blot分析鑒定。

1.2.2棋盤滴定法確定最佳SjSDISP抗原包被濃度、血清稀釋度 取10份健康人血清混合、10份血吸蟲病患者血清混合作為參陰、參陽模式血清。通過棋盤滴定法來決定最佳SjSDISP抗原的包被濃度和血清最佳稀釋度：將抗原稀釋至10 μg/mL-1、5 μg/mL-1、2.5 μg/mL-1、1.5 μg/mL-1、1.0 μg/mL-1，參陽、參陰患者血清分別按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋度稀釋，最后利用酶標(biāo)儀測定每孔OD450值，計算P/N值。P/N值=(陽性對照孔OD450平均值-空白對照孔450 n均值)/(陰性對照孔OD450均值-空白對照孔OD450均值)。以P/N值最大的反應(yīng)條件為間接ELISA的最優(yōu)包被濃度、血清稀釋度為判定依據(jù)。

1.2.3對rSjSDISP F-ELISA檢測日本血吸蟲病陽性診斷閾值的確定及該診斷方法的敏感度、特異度、約登指數(shù)及診斷效能的檢測 rSjSDISP F-ELISA檢測30份健康人血清、31份寄生蟲病患者血清(其中18份日本血吸蟲患者的血清、9份肺吸蟲患者血清、4份肝吸蟲患者血清)，每份樣品設(shè)立復(fù)孔，結(jié)果取其平均值，對其結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，繪制ROC曲線。根據(jù)ROC曲線圖得到約登指數(shù)最大的切點為最佳臨界點，即ROC曲線圖橫坐標(biāo)與縱坐標(biāo)相加為最大值時所對應(yīng)的點為最佳臨界點[7-8]。分析此種診斷方法的敏感度(Se)、特異度(Sp)、陽性似然比、陰性似然比、約登指數(shù)(Youden指數(shù))及診斷效能E[9]。

1.2.4rSjSDISP F-ELISA檢測不同血吸蟲感染時期的兔血清

1.2.4.1早期感染兔血清的制備 取9只健康新西蘭大白兔，采用腹部貼片法經(jīng)腹部皮膚攻擊感染500±50尾日本血吸蟲尾蚴。分別于感染前1 w、感染后第1 w～5 w，每w自兔耳緣靜脈采血5 mL/只(共6組)，分離血清，標(biāo)記，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2rSjSDISP F-ELISA早期診斷價值 取SEA-IHA試劑盒中參陰、參陽兔血清作為rSjSDISP F-ELISA質(zhì)控對照，與SEA-IHA平行檢測6組早期感染兔血清，觀察并比較兩者的早期診斷結(jié)果。

1.2.5比較rSjSDISP F-ELISA、SEA-IHA和SEA F-ELISA 3種方法的敏感度和特異度 取參陰、參陽模式血清做為對照，利用3種方法平行檢測335份待測人血清，分析其結(jié)果，采用卡方檢驗(利用SPSS17.0統(tǒng)計分軟件)比較3種方法的敏感性和特異性。

2 結(jié) 果

2.1pET-32a/SjSDISP重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達產(chǎn)物的鑒定

2.1.1SjSDISP原核重組表達質(zhì)粒的鑒定 對含有單克隆菌的過夜培養(yǎng)液進行菌液PCR，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠鑒定顯示，在約837 bp處有一清晰條帶，與目的基因大小一致；對提取的重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ雙酶切后，發(fā)現(xiàn)在約5 999 bp、837 bp處有兩條條帶，而空載體pET32a經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶雙酶切后僅發(fā)現(xiàn)一條5 999 bp左右的條帶(圖1)。測序證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.1.2SjSDISP重組蛋白表達的最優(yōu)條件 不同誘導(dǎo)條件的SDS-PAGE結(jié)果如圖2、圖3、圖4，發(fā)現(xiàn)IPTG終濃度為0.1 mmol/L，28 ℃誘導(dǎo)6 h時SjSDISP重組蛋白表達量最大。

2.1.3重組蛋白的純化 12% SDS-PAGE膠電泳發(fā)現(xiàn)rSjSDISP可溶性表達效果良好，洗脫液中條帶單一，純度在95%以上，結(jié)果見圖5。

圖1重組質(zhì)粒pET32a/SjSDISP雙酶切及菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果

Fig.1AgarosegelelectrophoresisforidentificationofplasmidpET32a/SjSDISPdigestionwithrestrictionenzymeandPCRamplification

Lane M: DNA marker 1 kb; Lane 1: pET32a plasmid; Lane 2: pET32a digested byBamH I andSalI; Lane 3: pET32a/SjSDISP plasmid;

Lane 4: pET32a/SjSDISP digested byBamH I andSalI; Lane 5: PCR products of pET32a/SjSDISP; Lane M': DNA marker DL2000

圖2不同誘導(dǎo)溫度對rSjSDISP蛋白表達量影響的SDS-PAGE結(jié)果

Fig.2EffectsofvariedinductiontemperatureontheexpressionoftherSjSDISP

Lane 1: pET32a/SjSDISP with IPTG induction at 36℃; Lane 2: pET32a/SjSDISP with IPTG induction at 32 ℃;Lane 3:pET32a/SjSDISP with IPTG induction at 28 ℃; Lane 4: pET32a/SjSDISP with IPTG induction at 24 ℃; Lane 5: pET32a/SjSDISP with IPTG induction at 20 ℃; Lane M: Protein marker;

2.1.4SjSDISP原核重組蛋白的Western-blot免疫原性鑒定 純化后的SjSDISP重組蛋白不被PBS、山羊抗小鼠二抗、日本血吸蟲陰性小鼠血清識別，能特異的被鼠His-tag 抗體、日本血吸蟲陽性小鼠血清識別，而且兩者所識別的條帶大小完全相符(圖6)，約在52.0 kDa處，說明SjSDISP重組蛋白表達純化成功，并且具有很好的免疫原性。

圖3不同誘導(dǎo)時間對rSjSDISP蛋白表達量影響的SDS-PAGE結(jié)果

Fig.3EffectsofvariedinductiontimeontheexpressionoftherSjSDISP

Lane 1: pET32a/SjSDISP with IPTG induction for 6 hours;Lane 2: pET32a/SjSDISP with IPTG induction for 5 hours;Lane 3: pET32a/SjSDISP with IPTG induction for 4 hours;Lane 4: pET32a/SjSDISP with IPTG induction for 3 hours;Lane 5: pET32a/SjSDISP with IPTG induction for 2 hours.Lane 6: pET32a/SjSDISP with IPTG induction for 1 hours.;Lane M: Protein marker

圖4不同IPTG終濃度對rSjSDISP蛋白表達量影響的SDS-PAGE結(jié)果

Fig.4TheSDS-PAGEresultofrSjSDISPinducedwithdifferentdoseofIPTG

Lane 1: pET32a/SjSDISP inducted by 0.5 mmol/L IPTG; Lane 2: pET32a/SjSDISP inducted by 0.2 mmol/L IPTG; Lane 3: pET32a/SjSDISP inducted by 0.1 mmol/L IPTG; Lane 4: pET32a/SjSDISP inducted by 0.05 mmol/L IPTG; Lane 5: pET32a/SjSDISP inducted by 0.02 mmol/L IPTG; Lane 6: pET32a/SjSDISP inducted by 0.01 mmol/L IPTG; Lane M: Protein marker.

2.2rSjSDISP抗原快速ELISA的最佳抗原包被濃度、血清稀釋度 對棋盤滴定法測定結(jié)果(表1)分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)rSjSDISP抗原的包被濃度為1.5 μg/mL時，血清稀釋度為1∶50時P/N值最大，故選以上條件為抗原最佳包被濃度，待檢血清最佳稀釋度。

圖5重組蛋白rSjSDISP純化結(jié)果

Fig.5PurificationofrecombinatproteinrSjSDISP

Lane 1: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21wash by imidazole buffer of 500 mM; Lane 2: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21wash by imidazole buffer of 250 mM; Lane 3: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21wash by imidazole buffer of 100 mM; Lane 4: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21wash by imidazole buffer of 75 mM ; Lane 5: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21wash by imidazole buffer of 50 mM; Lane 6: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21wash by imidazole buffer of 20 mM; Lane 7: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21 wash through; Lane 8: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21; Lane M: Protein marker.

圖6重組蛋白rSjSDISPWesternblotting抗原性鑒定結(jié)果

Fig.6ResultofWesternblottingfortherSjSDISP

Lane M: ProView protein marker; Lane 1: rSjSDISP incubated with rat sera infected by schistcsomiasis; Lane 2: rSjSDISP incubated with normal rat sera; Lane 3: rSjSDISP incubated with anti-His-tag antibody; Lane 4: rSjSDISP incubated with PBS.

2.3日本血吸蟲病診斷閾值的確定及診斷實驗的評價 經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，得ROC曲線(圖7)，曲線下的面積為0.970，說明診斷準(zhǔn)確度較高。ROC曲線越靠近左上角，曲線下面積越大，診斷效率越高，當(dāng)OD450nm=0.187時，敏感度為94.4%，特異度為93.0%，為診斷日本血吸蟲病的最佳臨界值，即當(dāng)OD450nm≥0.187時可判定為血吸蟲陽性血清。

表1 SDISP重組蛋白最佳抗原包被濃度、血清最佳稀釋度的選擇

圖7rSjSDISPF-ELISA檢測ROC曲線圖

Fig.7DiagramofROCcurveofrSjSDISPF-ELISAexamination

rSjSDISP F-ELISA檢測30份健康人血清、31份寄生蟲病患者血清結(jié)果如表2。rSjSDISP F-ELISA檢測確診血清的敏感度、特異度、約登指數(shù)及診斷效能等結(jié)果見表3。從以上結(jié)果可以看出采用rSjSDISP F-ELISA在檢測9份肺吸蟲病患者血清時，出現(xiàn)1份假陽性，但是其總的特異度達到了93.0%，說明此種診斷方法特異性尚可。rSjSDISP F-ELISA陽性似然比為13.6，說明rSjSDISP F-ELISA檢測陽性是糞檢陽性的13.6倍；rSjSDISP F-ELISA陰性似然比為0.054，說明rSjSDISP F-ELISA檢測為陰性為來自糞檢陰性可能性僅為陽性的0.054倍；在血吸蟲病流行率(P)分別為1%、5%、15%的地區(qū)，該測試系統(tǒng)診斷符合率的理論預(yù)測值分別為0.932，0.931，0.933。

2.4rSjSDISP F-ELISA的最早檢測時期 經(jīng)過rSjSDISP F-ELISA和SEA-IHA平行檢測日本血吸蟲早期感染的6組兔血清，檢測結(jié)果見表4。對數(shù)據(jù)進行卡方檢驗分析，兩種血清學(xué)診斷方法檢測結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義。即兩者都在日本血吸蟲感染第28 d區(qū)別出現(xiàn)陽性反應(yīng)。SEA-IHA在血吸蟲感染后第3 w檢測出陽性1例，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 rSjSDISP F-ELISA檢測結(jié)果

2.5rSjSDISP F-ELISA與SEA-IHA、SEA F-ELISA 3種方法檢測結(jié)果比較 用rSjSDISP F-ELISA、SEA-IHA和SEA F-ELISA 3種方法檢測335份待測人血清，檢測結(jié)果如表5、6。對表5、6數(shù)據(jù)進行卡方檢驗分析發(fā)現(xiàn)，按α=0.05水準(zhǔn)，P值分別為0.741、0.657都遠大于檢驗水準(zhǔn)0.05，可認(rèn)為rSjSDISP F-ELISA與SEA-IHA兩種診斷方法所檢測的結(jié)果無顯著性差異；重組抗原rSjSDISP與蟲卵可溶性抗原SEA所檢測結(jié)果的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

目前，我國血吸蟲病流行已處于較低水平的態(tài)勢，導(dǎo)致現(xiàn)有檢測方法難以快速確診的原因之一[10-11]。因此，探討提高檢測敏感性為導(dǎo)向的低度流行區(qū)檢測技術(shù)與方法，成為我國血吸蟲病診斷研究的重點[12]。常規(guī)改良加藤氏糞檢方法在低流行區(qū)漏檢率高，尤其對輕度慢性感染者、晚期患者等，難以查出病原體而易致漏診，人為地造成對疫情的低估，增加了對傳播控制地區(qū)和傳播阻斷地區(qū)輸入性傳染源的監(jiān)測難度。傳統(tǒng)的血清免疫學(xué)檢測方法，多基于混合的蟲卵可溶性抗原，成分復(fù)雜，常常影響檢測的特異性，結(jié)果重復(fù)性較差；而且抗原制備周期長、制備成本高，難以批量化生產(chǎn)，以致難以滿足現(xiàn)場的大規(guī)模應(yīng)用。隨著基因克隆技術(shù)的不斷完善與成熟，利用基因重組技術(shù)制備重組抗原，不但可以滿足現(xiàn)場推廣應(yīng)用所需的大量抗原材料，而且彌補了粗抗原制作及應(yīng)用過程中的諸多不足。重組抗原制備簡單易行，且成本低、使用安全、重復(fù)性好。日本血吸蟲琥珀酸脫氫酶鐵硫蛋白(SjSDISP)存在于血吸蟲生活史各期，廣泛分布在日本血吸蟲童蟲、成蟲的體壁上，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高滴度抗體，且對動物具有較好的免疫效果[13]。本文通過對SjSDISP原核重組蛋白進行Western blot免疫原性鑒定發(fā)現(xiàn)純化后的SjSDISP重組蛋白能特異性識別日本血吸蟲感染鼠血清，說明其具有成為診斷候選抗原的潛在價值。

表3 rSjSDISP F-ELISA檢測結(jié)果的Youden指數(shù)、似然比及診斷效能

表4rSjSDISPF-ELISA與SEA-IHA檢測五組不同日本血吸蟲感染時期兔血清結(jié)果

Tab.4ResultoftherSjSDISPF-ELISAandIHAinthedetectionoffivegroupsofrabbitserumindifferentinfectedperiodsbyschistosomiasis

TimeSjSDISP F-ELISASEA-IHAPositive countsNegative countsPositive countsNegative countsThe first week before infection0909The first week after infection0909The second week after infection0909The third week after infection0918The forth week after infection9090The fifth week after infection8190

表5rSjSDISP與SEA抗原的敏感性與特異性的比較

Tab.5ComparisononthedetectionresultofF-ELISAusingrSjSDISPandSEAascoatingantigen

SjSDISP F-ELISASEA F-ELISAPositive countsNegative countsTotalPositive counts17038208Negative counts4384127Total213122335

表6SjSDISPF-ELISA與SEA-IHA檢測結(jié)果的比較

Tab.6ComparisononthedetectionresultofF-ELISAusingrSjSDISPandIHA

rSjSDISP F-ELISASEA-IHAPositive countsNegative countsTotal Positive counts17543218Negative counts3978117Total214121335

本實驗通過對SjSDISP快速ELISA與SEA-IHA檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，本實驗還比較了以重組抗原SjSDISP為包被抗原和以SEA為包被抗原的ELISA所診斷的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義說明rSjSDISP具有與SEA抗原相似的敏感度和特異度。血吸蟲早期感染兔血清的檢測結(jié)果，證明rSjSDISP F-ELISA與SEA-IHA都可在尾蚴感染新西蘭兔后第28 d檢出相應(yīng)抗體，說明rSjSDISP與SEA在早期診斷方面也具有相似的診斷價值，均較糞檢蟲卵的時間提前了1 w以上。但是，rSjSDISP原核融合蛋白是基因工程重組蛋白分子，容易大量制備，成本低廉。研究結(jié)果顯示，重組抗原SjSDISP可作為可溶性蟲卵抗原SEA的替代抗原，對血吸蟲病具有較好的診斷價值。但是，9例肺吸蟲病人中出現(xiàn)1例陽性反應(yīng)，有關(guān)重組抗原SjSDISP與其他寄生蟲病方面的交叉反應(yīng)問題，還有待進一步擴大樣本后的深入研究。

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