徐艷冰，王乃志，楊麗麗，崔華東，薛紅霞，張　寧

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院第二風濕免疫科，沈陽 110001)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節(jié)組織慢性炎癥性病變?yōu)橹饕憩F的自身免疫性疾病。膠原誘導關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠與RA病理機制類似，加之對自身免疫的敏感性，是常用的實驗模型[1]。

肽基精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase 4，PADI4)是一種翻譯后修飾酶，可將精氨酸殘基轉化為瓜氨酸殘基。PADI4在RA患者血清中含量明顯升高，在機體內產生自身抗PADI4抗體，并且PADI4瓜氨酸化多種蛋白質引起機體自身的免疫反應參與RA的發(fā)生與發(fā)展[2-5]。本研究擬在CIA大鼠模型上應用PADI4特異性抗體，觀察其與CIA的相關性，探討PADI4在CIA不同時期發(fā)病中的作用，以為臨床診斷RA提供新的理論依據，并為RA治療提供方向。

材料和方法

實驗動物及分組

2012年7月至2013年5月中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗中心將清潔級雌性Wistar大鼠[(體重為(100±20) g]30只(盛京醫(yī)院實驗中心動物部提供)適應性飼養(yǎng)1周后隨機選取6只為對照組，其余24只均建立CIA模型，其中6只模型建立失敗，其余關節(jié)炎模型建立成功且關節(jié)炎指數(arthritis index，AI)>2分的18只大鼠隨機分為CIA3周模型組、CIA4周模型組及CIA6周模型組，每組6只。分別予以生理鹽水1 ml/d(對照組)、0.5 mg/ml雞Il型膠原(CIA模型組)皮內注射，并于免疫后3，4，6周按組別處死。比較各組大鼠體重、關節(jié)炎指數、足趾容積及PADI4表達的變化情況。參考對照組評價PADI4與關節(jié)炎的相關性。

主要藥品及試劑

雞Ⅱ型膠原(CCⅡ)及完全弗氏佐劑(CFA)為Sigma公司產品，PADI4抗體購自NOVUS公司。

CIA模型建立

將用0.1 mol/L冰醋酸溶解的CCⅡ與等體積的CFA充分乳化，配成終濃度為0.5 g/L的乳劑。大鼠用水合氯醛(用量0.3 ml/100 g)麻醉后，模型組于大鼠背部及鼠尾根部多點皮下注射配制好的Ⅱ型膠原溶液，總量為1 ml。1周后上述方法、相同劑量再進行1次。對照組注射等體積的生理鹽水。

取材與包埋

實驗結束時處死大鼠，取左后足跖趾關節(jié)，10%多聚甲醛固定1周，脫鈣液(鹽酸加甲酸溶液)脫鈣，用大頭針檢測脫鈣滿意后，將關節(jié)常規(guī)脫水、包埋、切片；同時分離雙側膝關節(jié)滑膜組織，立即放入液氮中，隨后-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

抗PADI4抗體測定

采集CIA模型鼠及正常對照組鼠靜脈血2 ml，離心后血清分裝，并于-80℃低溫冰箱保存待測。酶聯免疫吸附試驗PADI4抗體試劑盒購自美國R&D公司，具體步驟按照說明書進行。每板均設陰性對照、陽性對照。以正常對照組抗PADI4抗體濃度的第95百分位數的可信區(qū)間最大值定陽性閾值。

免疫組織化學染色

跖趾關節(jié)標本均用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，采用SP染色，經二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水，組織抗原熱修復。滴加一抗(1∶150的兔抗PADI4)后4℃冰箱孵育過夜；滴加二抗，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素，室溫孵育20 min。各步驟間以PBS沖洗5 min，連續(xù)3次。DAB顯色，蘇木精復染。光鏡下觀察，胞膜或胞漿著棕黃或棕色者為陽性表達。計算染色后PADI4表達陽性細胞的數目。每個處理組做3張染片，每張染片隨機計數10個非重疊視野(×400)下的陽性細胞數。圖片采集設備為NIS-Elements F3.0，分析軟件為Nikon NIS-Elements BR3.0。

蛋白質印跡Western blot檢測

采用不同時期CIA大鼠膝關節(jié)滑膜進行。取保存于-80℃中的膝關節(jié)滑膜，加入適量裂解液裂解滑膜組織，超聲破碎儀破碎組織后取上清，采用BCA Protein Assay Kit測蛋白濃度后，每個樣品均調整為40 μg/μl的蛋白終濃度，每孔上樣20 μl后進行SDS-PAGE電泳。電壓強度為80 V，電泳1 h后，改為120 V，電泳2 h。電泳結束后，進行轉膜，電轉移的條件設定為恒電壓100 V，2 h。然后將PVDF膜浸泡入5%的脫脂牛奶中2 h，加入一抗后4℃孵育過夜(1∶1 000的兔抗PADI4，1∶15000鼠抗GAPDH)。復溫30 min，TBST洗膜后加入二抗(1∶5 000的辣根過氧化物酶驢抗兔/小鼠IgG)室溫下孵育2 h，TBST洗膜后進行ECL顯色反應、曝光、顯影、過水、定影。

觀察指標

一般情況觀察：大鼠體毛色澤、活動狀態(tài)、排便及食量的變化情況并每周測定大鼠體重。

AI：根據關節(jié)腫脹、顏色及關節(jié)活動情況記錄并評價大鼠全身關節(jié)病變程度，每7天評定1次，共評定6次。評分標準：0分，無紅腫；1分，小趾關節(jié)稍腫；2分，趾關節(jié)和足趾腫脹；3分，踝關節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關節(jié)在內全部足爪腫脹。四肢肢體的病變程度累積積分為AI，最高為16分。

足趾容積測定：根據排水法原理，用自制的關節(jié)容積測量器測量大鼠左后足雙踝連線以下全足容積，每周測量1次，共測6次。

統(tǒng)計學處理

結　　果

一般情況

致敏后約第14天大鼠足部及踝關節(jié)皮膚開始發(fā)紅，輕度腫脹，關節(jié)炎開始形成。約第28天左右，關節(jié)腫脹達高峰，體重增長緩慢(表1)。左側足趾容積變化見表2。

血清抗PADI4抗體水平及陽性率比較

CIA組血清中抗PADI4抗體陽性率為44.4%(8/18)，高于對照組16.67%(1/6)，兩組陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

免疫組織化學染色

PADI4在骨組織和滑膜中的分布基本相同。陽性表達主要位于軟骨周邊單核細胞、侵潤細胞胞漿及骨髓腔中，陽性細胞數明顯多于對照組，且染色亦深于對照組(圖1)。

CIA組初次免疫3、4、6周后骨組織中PADI4蛋白陽性細胞染色光密度值分別為(0.2898±0.0120)、(0.2982±0.0220)、(0.2974±0.0310)，明顯高于對照組(0.2530±0.0127)，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。初次免疫后第3周，部分細胞內可見少量PADI4陽性表達；第4周時PADI4表達明顯增多，隨著病情的進展，其表達有所減少。

蛋白質印跡檢測結果

初次免疫后第3周，可見PADI4陽性表達條帶；第4周PADI4蛋白表達條帶強度最深，隨后其表達水平降低；實驗結束時，即第6周仍有陽性表達(圖2)。

討　　論

表1各組大鼠實驗不同階段體重變化

分組0d7d14d21d28d42d對照組111 00±5 10155 50±3 11183 25±6 13197 50±6 36251 00±5 19257 01±3 89膠原誘導關節(jié)炎模型組112 17±11 16152 33±12 39169 00±13 80190 00±22 63207 00±33 94247 50±42 97

表2各組大鼠實驗不同階段左側足趾容積變化

分組0d7d14d21d28d42d對照組1 263±0 0761 335±0 1011 447±0 1011 522±0 1561 630±0 1371 707±0 124膠原誘導關節(jié)炎模型組1 255±0 1301 355±0 0831 472±0 1041 963±0 1342 421±0 1202 290±0 121

RA以關節(jié)滑膜炎性反應為特征，疾病多呈漸進型發(fā)展。早診斷、積極治療是預防控制RA病情發(fā)展的前提，但是鑒別診斷RA和其他自限性疾病比較困難，確診RA往往要在數月甚至數年之后，易造成不可逆轉的關節(jié)畸形和強直，致殘率較高，嚴重影響患者的生活質量?？弓h(huán)瓜氨酸肽抗體(anticyclic citrullinated peptide antibody，anti-CCP)是目前特異性相對最好的早期診斷指標之一，能在出現臨床癥狀之前就出現并可被檢測到，對于早期、非典型、類風濕因子陰性的RA患者有較大的診斷價值，且與RA的嚴重程度相關。肽酰精氨酸脫亞胺基酶(peptidylarginine deiminase，PADI)是催化精氨酸轉化為瓜氨酸的關鍵性酶，其基因多態(tài)性也因此成為研究RA易感性和發(fā)病機制的熱點[6-8]。在RA患者體內，PADI蛋白本身也可以成為自身抗體的目標[9-11]，并且可能在原位形成免疫復合物促進了炎性反應[12]。RA患者血清中存在特異性抗PADI4抗體，陽性率為50%，與病情程度相關[9-10]。國內研究顯示，抗PADI4抗體對RA診斷的敏感性為45%，特異性為93.5%，RA患者血清中抗PAID4抗體的陽性率是45%，抗PADI4抗體與病情活動指病活動性評分和抗CCP抗體具有相關性[13]。Shi等[14]進一步研究發(fā)現，50%類風濕因子陰性RA患者中抗PADI4抗體陽性，43%抗角蛋白抗體陰性患者中抗PADI4抗體呈陽性，60% CCP陰性患者中抗PADI4抗體陽性。以上結果表明抗PADI4抗體是RA特異性較高的抗體，尤其在類風濕因子、抗角蛋白抗體和抗CCP抗體陰性RA患者中有較高診斷價值。有研究顯示RA患者體內產生的抗PADI4抗體以IgG1和IgG3兩個亞群為主[15]，主要識別PADI4的4個線性肽段，即N端序列P22(211～230)、P28(271～290)，C端序列P61(601～620)、P63(621～640)，自身抗體可能是通過阻止PADI4與鈣離子和底物的結合從而抑制PADI4介導的纖維蛋白原瓜氨酸化過程[16]。然而RA患者自身如何產生抗PADI4抗體的機理尚未明了，一種可能是機體在對瓜氨酸蛋白產生免疫反應之后通過表位擴展進而產生了抗PADI4抗體；另一種可能是某種基因亞型的患者體內PADI4表達增加，進而打破免疫耐受產生抗體[13]。抗PADI4抗體是否參與或如何參與RA發(fā)展過程并未闡明?？梢钥隙ǖ氖?，PADI4與RA的發(fā)生與發(fā)展相關，可能是RA的致病抗原之一。PADI4或抗PADI4抗體可以成為新的臨床輔助檢測標志物，但是對于PADI4如何打破免疫耐受仍然未知。

CIA是于1977年發(fā)現，因其臨床表現、關節(jié)病理、細胞及體液免疫等方面與人類RA接近，被廣泛用于RA發(fā)病機制及藥物評價等方面的研究，是目前比較理想的RA模型[17]。本實驗設想若鼠關節(jié)炎模型與人RA中PADI4的表達情況相似，從而可更方便、簡潔、有效的進行活體實驗。對PADI4研究的深入不僅有助于理解翻譯后修飾在生命過程中的重要意義，還可以對未來藥物的開發(fā)提供新的方向。而且PADI4與RA相關性的研究對闡明RA的發(fā)病機制和RA的診斷有著十分重要的意義，有可能為RA的治療開辟新途徑。

本研究顯示，在CIA發(fā)病的早期即初次免疫后第3周，PADI4即處于陽性表達狀態(tài)，早于臨床癥狀即關節(jié)腫脹之前出現，隨后PADI4表達逐步升高，到初次免疫后第4周達到高峰，后略有降低，但直到6周實驗結束時，PADI4仍處于較高水平的陽性表達狀態(tài)。從上述實驗結果可以看出，在CIA發(fā)病過程中，PADI4在疾病發(fā)展過程中處于早期陽性狀態(tài)。通過本研究結果可以推測，抑制PADI4基因表達有望用于RA的治療，但蛋白的復制翻譯轉錄是一個復雜的過程，各途徑之間存在各種交互聯系，相互協同、相互制約共同介導RA病理過程，因此，還需要大量的動物實驗及臨床試驗來進一步研究。因此，抑制PADI4基因表達能否用于RA的治療，還需要大量的動物及臨床實驗來證實。

(本文圖1、2見插頁Ⅰ)

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