吳德南，莊建良，許榮譽(yù)，蘇子劍，何榮琦

人類機(jī)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展與患者的免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)，免疫功能降低是腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移最關(guān)鍵的內(nèi)因。Tregs細(xì)胞是具有一類特殊表型和抑制功能的T淋巴細(xì)胞亞群，可通過(guò)多種方式抗腫瘤免疫反應(yīng)，在腫瘤免疫逃逸中起著重要作用。腫瘤可以通過(guò)多種途徑來(lái)引導(dǎo)Tregs細(xì)胞在腫瘤局部的聚集和維持，其中最重要的一種方式為腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)趨化因子。特別是CCL5-CCR5軸在參與及調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞向外浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸等方面在近幾年引起廣泛研究。Azenshtein等[1]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞可以表達(dá)和分泌趨化因子CCL5及受體CCR5，兩者相互作用趨化淋巴細(xì)胞向腫瘤部位移動(dòng)，促進(jìn)疾病發(fā)展，并且CCR5表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞有明顯向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移趨勢(shì)，這可能與淋巴結(jié)內(nèi)存在CCL5有關(guān)。本研究將初步探討CCR5在胃癌外周血Tregs細(xì)胞上的表達(dá)水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 試劑和儀器 FACSsort型流式細(xì)胞儀、GS-15型離心機(jī)：美國(guó)BECKMAN公司生產(chǎn)。WH-2型微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠生產(chǎn)。可調(diào)式微量移液器：德國(guó)Eppendrof公司。鼠抗人CD4-ECD及CD25-PC5均購(gòu)自美國(guó) BECKMAN COULTER MUNOTECH公司。CCR5單克隆抗體：美國(guó)R&D公司。CD127單克隆抗體：美國(guó) eBioscience公司。Falcon管及溶血素均購(gòu)自美國(guó)BD公司。人淋巴細(xì)胞分離液：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 標(biāo)本來(lái)源及分組 收集2013年1月至2014年2月于福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院腫瘤外科住院且經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為胃癌的患者49例，均為初治病例，術(shù)前均未接受放射治療、化學(xué)治療、免疫治療及靶向治療。其中男33例，女16例，年齡為40～80歲，中位年齡61歲，年齡<55歲11例，≥55歲38例。胃癌TMN分期標(biāo)準(zhǔn)采用2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟/美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(UICC、AJCC) 的分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期患者10例，Ⅱ期患者15例，Ⅲ期患者24例。鏡下病理組織分化程度分組：低分化26例，中高分化23例。49例中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例。腫瘤直徑：直徑<5 cm 24例，直徑≥5 cm 25例。另外同期選取我院體檢中心正常體檢者20例作為健康對(duì)照組，經(jīng)電子胃鏡取材并經(jīng)病理證實(shí)無(wú)胃部疾病，其中男13例，女7例，年齡43～77歲，中位年齡60歲，年齡<55歲7例，≥55歲13例。胃癌組和對(duì)照組在性別、年齡等方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有對(duì)象均無(wú)自身免疫性疾病、免疫缺陷疾病、器官移植或其他部位腫瘤；且近4個(gè)月未使用過(guò)免疫增強(qiáng)和(或)抑制性藥物。

1.3 研究方法及操作步驟 (1) 標(biāo)本血采集：收集胃癌患者術(shù)前以及健康對(duì)照組外周血2 ml于EDTA抗凝管中，充分混勻。(2)利用Ficoll密度梯度離心法分離人外周單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)：往抗凝管中加入的PBS緩沖液等體積(1∶1)稀釋血液。取淋巴細(xì)胞分層液1.5 ml，放入15 ml的離心管，用吸管吸取稀釋血液3 ml，沿試管壁加入，使稀釋血液量疊于分層液上，保持兩者界面清晰。然后以1 800 r/min離心10 min，離心后其中的內(nèi)容物分為4層，用毛細(xì)吸管輕輕插入白膜層，沿試管壁周緣吸取界面層單個(gè)核細(xì)胞，移入另一離心管中。加入5 ml的PBS緩沖液，混勻，以2 800 r/min離心5 min兩次，吸棄上清，重懸細(xì)胞。(3)加入抗體：吸取25 μl細(xì)胞懸液在Falcon管，向管中加入10 μl CCR5-FITC、10 μl CD25-PC5、20 μl CD127-PE和10 μl CD4-ECD標(biāo)記的抗體，充分混勻后，低溫避光孵育45 min。同時(shí)設(shè)同型陰性對(duì)照管，只加入50 μl細(xì)胞懸液。(4) 加入溶血素，室溫避光8 min。(5)2 800 r/min離心5 min兩次，棄上清。(6) 加入300 μl PBS緩沖液，檢測(cè)。(7) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果：設(shè)立同型陰性對(duì)照，設(shè)立淋巴細(xì)胞門，檢測(cè)淋巴細(xì)胞數(shù)量和Tregs細(xì)胞上CCR5的表達(dá)水平。

1.4 檢測(cè)及數(shù)據(jù)采集 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)每一例胃癌患者及健康對(duì)照組的外周血，檢測(cè)CCR5在外周血Tregs細(xì)胞上表達(dá)水平。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：t檢驗(yàn)、方差分析、多元線性回歸分析及秩相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCR5在胃癌患者組與健康對(duì)照組外周血Treg細(xì)胞上表達(dá)水平的比較 胃癌患者組與健康對(duì)照組的比較檢測(cè)采用t檢驗(yàn)，結(jié)果t=7.5，P<0.01；差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為胃癌患者組外周血Tregs細(xì)胞上CCR5表達(dá)水平比健康對(duì)照組高。說(shuō)明CCR5在外周血Tregs細(xì)胞上的表達(dá)與胃癌的存在狀態(tài)有關(guān)。詳見(jiàn)表1。

表1 胃癌患者組與健康對(duì)照組CCR5表達(dá)水平比較結(jié)果

2.2 CCR5在外周血Tregs細(xì)胞的表達(dá)水平與胃癌相關(guān)參數(shù)的關(guān)系 胃癌患者外周血中Tregs細(xì)胞上CCR5的表達(dá)水平在TNM 分期、分化程度及淋巴轉(zhuǎn)移組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) ，而在性別、年齡及腫瘤大小參數(shù)中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

2.3 CCR5在外周血Tregs細(xì)胞的表達(dá)水平與胃癌病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析 先將CCR5在胃癌患者外周血Treg細(xì)胞表達(dá)水平結(jié)果與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期(TNM分期)進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果僅有病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移兩項(xiàng)進(jìn)入方程。結(jié)果詳見(jiàn)表3。表3表明 CCR5在胃癌患者外周血Treg細(xì)胞的表達(dá)水平與性別、年齡、分化程度、腫瘤大小無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的線性關(guān)系，與病理分期(B=0.331,P=0.005)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(B=0.783,P=0.000)呈線性關(guān)系，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示CCR5在胃癌患者外周血Treg細(xì)胞的表達(dá)水平受胃癌的病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響顯著。此外，對(duì)CCR5的表達(dá)程度與性別、年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期分別進(jìn)行兩個(gè)變量的秩相關(guān)分析，結(jié)果詳見(jiàn)表4。從4表中可知，CCR5在外周血Treg細(xì)胞的表達(dá)水平與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，均呈正直線相關(guān)關(guān)系，與性別、腫瘤大小及年齡均無(wú)直線相關(guān)關(guān)系。與腫瘤分化程度秩相關(guān)雖然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其r<0.5，提示其與CCR5表達(dá)水平關(guān)系不密切。

表2 CCR5表達(dá)水平與胃癌相關(guān)參數(shù)的關(guān)系

表3 CCR5表達(dá)與胃癌病理學(xué)參數(shù)的多元線性回歸分析結(jié)果

表4 CCR5表達(dá)與胃癌病理學(xué)參數(shù)的秩相關(guān)分析結(jié)果

3 討論

CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)抑制自身的免疫抗原和抑制過(guò)度的免疫應(yīng)答以維持機(jī)體免疫平衡方面起著關(guān)鍵性的作用。Tregs細(xì)胞比例升高會(huì)導(dǎo)致腫瘤免疫失調(diào)，可能參與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。在近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子及其受體在Tregs細(xì)胞發(fā)揮免疫功能的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。趨化因子受體是一類表達(dá)于不同類型細(xì)胞上的G蛋白耦聯(lián)受體，含有7個(gè)跨膜區(qū)，通常表達(dá)于免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。趨化因子與其受體的相互作用控制著各種免疫細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)和組織器官間定向遷移[3]。CCR5在CD4+ T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、未成熟的DC等多種淋巴細(xì)胞上均有表達(dá)，參與不同的免疫反應(yīng)[4]。關(guān)于外周血Tregs上CCR5的表達(dá)和胃癌的關(guān)系，目前臨床研究較少。

在腫瘤免疫領(lǐng)域中，CCL5/CCR5信號(hào)軸途徑與Tregs如何相互介導(dǎo)、作用及作用方式近年來(lái)得到廣泛研究。CCL5/CCR5 信號(hào)軸可能通過(guò)對(duì)Tregs細(xì)胞的趨化，引起腫瘤組織及其引流區(qū)域的富集及維持來(lái)影響機(jī)體局部或整體的免疫功能，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。Tan等[5]研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者的外周血、腫瘤組織、腫瘤引流淋巴結(jié)中，Tregs 細(xì)胞數(shù)量較健康對(duì)照組多，Tregs 細(xì)胞表面表達(dá)的 CCR5 也較正常組織多，且胰腺癌組織中 CCR5 的配體 CCL3、CCL4、CCL5 的表達(dá)均增多，CCL5 與 CCR5 相互識(shí)別，趨化 Treg 細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織發(fā)揮作用，為證明CCL5/CCR5 信號(hào)軸的存在，該課題組又利用CCR5拮抗劑阻斷實(shí)驗(yàn)鼠中CCL5 / CCR5 信號(hào)軸后發(fā)現(xiàn)募集到腫瘤組織的Tregs細(xì)胞減少，減弱Tregs細(xì)胞的抗腫瘤免疫作用，腫瘤生長(zhǎng)受影響。這為腫瘤的分子靶向治療提供了研究方向。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，CCR5在胃癌外周血Tregs細(xì)胞上的高表達(dá)，表明CCR5可能參與了腫瘤免疫過(guò)程，加速腫瘤進(jìn)展及介導(dǎo)轉(zhuǎn)移，但是否可以通過(guò)阻斷它們的相互作用來(lái)治療胃癌，CCL5/CCR5信號(hào)軸與Tregs細(xì)胞在腫瘤免疫中有何種作用，仍需做進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)49例胃癌患者外周血Tregs細(xì)胞上CCR5的表達(dá)程度，與健康對(duì)照比較，并分析CCR5的表達(dá)與胃癌的病理分期(TNM分期)、腫瘤分化程度、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，初步探討CCR5與Tregs在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步分析得出以下結(jié)論：(1)CCR5在胃癌患者外周血Tregs細(xì)胞上高度表達(dá)，跟健康對(duì)照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測(cè)其參與了胃癌的發(fā)生過(guò)程；(2)CCR5的表達(dá)程度與胃癌的病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)，表現(xiàn)為其表達(dá)越高，提示腫瘤分期越晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越廣泛，我們也可以推測(cè)Tregs細(xì)胞上CCR5的表達(dá)參與了胃癌浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程。說(shuō)明CCR5與外周血Tregs細(xì)胞相互介導(dǎo)可能參與機(jī)體的腫瘤免疫，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中可能起重要作用。由于本試驗(yàn)病例選擇的限制，未對(duì)末期胃癌進(jìn)行研究，未得出他們與胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)的結(jié)果，這一問(wèn)題還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，從而得出更完善、有說(shuō)服力的結(jié)果。

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