林汝榕，邢炳鵬，柯秀蓉，蔡文旋，林錫煌，張稚蘭

基于正交實驗的高含量藻紅蛋白紫菜絲狀藻體優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件研究

林汝榕1，2，邢炳鵬1，2，柯秀蓉1，2，蔡文旋1，2，林錫煌1，2，張稚蘭1，2

（1.國家海洋局海洋大氣化學(xué)與全球變化重點實驗室，福建廈門 361005；2.國家海洋局第三海洋研究所，福建廈門 361005）

絲狀藻體在紫菜養(yǎng)殖的人工苗種生產(chǎn)中非常重要，在利用于分離提取高價值的藻紅蛋白方面也具有潛在的利用價值。本研究采集了成熟紫菜葉狀體的果孢子釋放的初始絲狀藻體，基于3因子3水平的正交實驗設(shè)計方案［采用具有分析交互作用的正交表L27（313）］，確定了絲狀藻體藻紅蛋白含量對環(huán)境因子的響應(yīng)以及優(yōu)化的調(diào)控培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，溫度、光照強度和鹽度因子對絲狀藻體藻紅蛋白含量均有顯著影響（P≤0.048 1），并且溫度和光照強度或鹽度因子間存在交互作用（P≤0.043 1），但光照強度和鹽度因子間的交互作用不顯著（P=0.469 8）。獲得的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件為：溫度18℃、光強1 500 lx、鹽度20或25。優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件下的絲狀藻體藻紅蛋白含量高達64.73 mg/g.dw（平均值±標(biāo)準偏差SD為58.24±5.07 mg/g.dw）。

壇紫菜；絲狀藻體；藻紅蛋白；正交實驗；溫度；光強；鹽度

0 引言

棲息于海洋環(huán)境的海洋藻類含有許多各種不同生物活性的天然產(chǎn)物，因此海洋藻類的開發(fā)利用長期以來都受到國內(nèi)外研究者的普遍關(guān)注［1-5］。藻紅蛋白（phycoerythrin）是存在于某些海洋紅藻藻體中的一種重要藻膽蛋白，具有清除體內(nèi)有害自由基、提高機體免疫力、抗氧化、抗輻射、抗衰老及抗腫瘤等方面的生物活性功能［6-10］。藻紅蛋白在紅藻藻體中除了作為與光合作用功能密切相關(guān)的重要輔助采光色素外，由于藻紅蛋白獨特的分子結(jié)構(gòu)，具有熒光發(fā)射性強、摩爾消光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高、斯托克位移大、熒光位于近紅光區(qū)、背景光干擾小、不易淬滅等特點，因此可作為性能優(yōu)異的熒光標(biāo)記物，在生物細胞分析、藥物分子體內(nèi)的轉(zhuǎn)移代謝、疾病診斷與預(yù)防等方面具有廣泛的應(yīng)用潛力［11-17］。

能否高效獲取藻紅蛋白主要取決于如下幾個方面：用于分離提取藻紅蛋白所需的藻材料是否容易得到；藻材料藻紅蛋白含量的高低；涉及分離提取方法步驟的難易程度；藻材料中存在的干擾分離純化成分量的多少等。其中采用人工調(diào)控培養(yǎng)技術(shù)獲得高含量藻紅蛋白藻體是解決高效制備藻紅蛋白的重要途徑。紫菜絲狀藻體不僅是紫菜養(yǎng)殖中人工育苗的重要藻材料，也具有開發(fā)利用于分離提取藻紅蛋白的潛在應(yīng)用價值。本研究通過具有交互作用分析的3因子（溫度、光強和鹽度）及3水平的正交實驗，探討了調(diào)控培養(yǎng)條件下，壇紫菜絲狀藻體藻紅蛋白含量對環(huán)境因子的響應(yīng)和優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件，為尋求培養(yǎng)生長狀況良好、藻紅蛋白含量高的絲狀藻體優(yōu)化培養(yǎng)條件方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 用于優(yōu)化培養(yǎng)條件實驗的絲狀藻體的獲取

于紫菜收成季節(jié)從莆田秀嶼紫菜養(yǎng)殖場采收成熟的紫菜葉狀體。用鑷子夾紗布，蘸滅菌海水小心清洗葉狀體表面，然后用滅菌海水淋洗3～5遍，置于15℃環(huán)境陰干4～10 h。用滅菌剪刀剪下葉狀體的成熟部位，放于裝有滅菌海水的1 000 m L的燒杯中。10～24 h后，取出葉狀體。在已有果孢子釋放的燒杯中加入滅菌過的f/2營養(yǎng)液，于鹽度20，溫度20℃，光照強度1 600 lx，光照周期（L∶D=16∶8）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至培養(yǎng)長出具有簇狀棕紅色的絲狀體藻絲。

1.2 優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件實驗設(shè)計及測定方法

1.2.1 實驗研究考察的因子和水平

影響壇紫菜絲狀藻體藻紅蛋白含量的因子水平設(shè)置見表1。

1.2.2 絲狀藻體的調(diào)控培養(yǎng)

由果孢子萌發(fā)長成的絲狀藻體材料按正交實驗方案［采用具有分析交互作用的正交表L27（313）］設(shè)置的相關(guān)條件進行調(diào)控培養(yǎng)，每組初始實驗時的絲狀藻體重量為10 mg。3因子（溫度、光強和鹽度）均設(shè)置3個水平（分別用1，2，3代碼表示）。設(shè)置的其他附帶固定培養(yǎng)條件為：p H 8.5、復(fù)合維生素質(zhì)量濃度15μg/L、Na HCO3濃度質(zhì)量2 mg/L、每天光照時數(shù)18 h、營養(yǎng)液濃度f/2。調(diào)控培養(yǎng)30 d后，測定絲狀藻體的藻紅蛋白含量。

1.2.3 藻紅蛋白的萃取及含量的計算

培養(yǎng)30 d后，用篩絹過濾培養(yǎng)的絲狀藻體，以控去水分，并用濾紙進一步吸干水分，放入研缽研磨成漿狀，加入0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液置于暗處4℃萃取20 h。樣品液用離心機10 000 r/min離心30 min，取上層藻紅蛋白萃取液，用分光光度計測定其在564，618和730 nm波長的吸光值，同時測定用濾紙吸去水分的絲狀體藻絲的質(zhì)量以及置于80℃干燥12 h后的藻體干質(zhì)量，確定出濕藻體和干藻體質(zhì)量比值，最后按SAMPATH-WILEY et al［18］的方法計算絲狀藻體的藻紅蛋白含量，表達為：毫克藻紅蛋白/克干重藻體（mg/g.dw）。

1.2.4 實驗結(jié)果的分析處理

根據(jù)3因子3水平的正交實驗設(shè)計，設(shè)置調(diào)控培養(yǎng)條件實驗，同時運用方差顯著性檢驗和分析的方法，考察3個因子（溫度、光強和鹽度）對絲狀藻體藻紅蛋白含量的影響，分析這些關(guān)鍵性因子的主次順序及交互作用、確定優(yōu)化的調(diào)控培養(yǎng)條件下因子水平的最佳搭配。

1.3 實驗試劑及儀器

實驗所用硝酸鈉、磷酸二氫鈉、硫酸鋅、硫酸銅、氯化錳、檸檬酸鐵、鉬酸鈉、乙二銨四乙酸鈉、六水氯化鈷、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸均為AR試劑，購自廈門綠茵試劑有限公司。復(fù)合維生素片為杭州民生藥業(yè)集團有限公司所生產(chǎn)。

實驗所用儀器包括：AL204電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），PGX-450C智能光照培養(yǎng)箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠），WY035Y手持式鹽度計（寧波市豐名儀器有限公司），ZDS-10照度計（上海嘉定學(xué)聯(lián)儀表廠），哈納HI98108手持式酸度計（上海樹信儀器儀表有限公司），Neofuge15R臺式高速離心機（香港力康發(fā)展有限公司）以及UV-2600紫外可見光分光光度計（北京瑞利儀器有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

采用SPSS 15.0軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)。

1.5 優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件的驗證

采用正交實驗獲得的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件，實施進一步的培養(yǎng)效果驗證。實施例證序號1～3的培養(yǎng)條件為溫度18℃，光強1 500 lx，鹽度20；實施例證序號4～5的培養(yǎng)條件為溫度18℃，光強1 500 lx，鹽度25。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件的正交實驗結(jié)果與分析

壇紫菜絲狀藻體藻紅蛋白含量的正交實驗結(jié)果及分析見表2。在不同的調(diào)控培養(yǎng)條件下，絲狀藻體藻紅蛋白含量表現(xiàn)出明顯的差異，其數(shù)值的變動范圍介于15.28～61.50 mg/g.dw之間。即表明不同的調(diào)控培養(yǎng)條件對絲狀藻體藻紅蛋白含量有相當(dāng)大的影響，數(shù)值大小相差最大可達4倍左右。因此，欲獲得具有高含量藻紅蛋白的絲狀藻體，調(diào)控培養(yǎng)條件十分重要。表2中正交實驗研究分析計算的極差值R的大小反映了相應(yīng)因子作用或因子之間交互作用對指標(biāo)值影響能力的大小，極差值大的因子，意味著其不同水平對指標(biāo)量所造成的差別較大，通常是主要因子；極差值小的因子，意味著其不同水平對指標(biāo)量所造成的差別較小，一般是次要因子。

本研究結(jié)果表明，溫度、光照強度和鹽度所造成的極差值R分別為169.66，126.23和50.53。因此，按極差值大小，影響絲狀藻體藻紅蛋白含量的因子的主次順序依次可排列為：溫度＞光照強度＞鹽度。從不同因素之間產(chǎn)生的交互作用影響的大小來看，溫度和光照強度產(chǎn)生的交互作用（A×B）所造成的極差值R為95.12，溫度和鹽度產(chǎn)生的交互作用（A×C）所造成的極差值R為96.58，光照強度和鹽度產(chǎn)生的交互作用（B×C）所造成的極差值R為45.74，因此，對于絲狀藻體的藻紅蛋白含量，因子間的不同組合所造成的交互作用的影響大小順序依次可排列為：A× C＞A×B＞B×C。若綜合考察主因素和因素間的交互作用對絲狀藻體藻紅蛋白含量的效應(yīng)（極差值R的大?。绊懡z狀藻體藻紅蛋白含量的大小順序依次可排列為：A＞B＞A×C＞A×B＞C＞B×C。

2.2 正交實驗結(jié)果的方差分析及兩因子間的交互作用分析

壇紫菜絲狀藻體藻紅蛋白含量正交實驗結(jié)果的方差分析見表3。調(diào)控培養(yǎng)條件下絲狀藻體藻紅蛋白含量的方差顯著性檢驗和分析的結(jié)果進一步清楚表明，所考察的3個環(huán)境因子均能顯著影響到絲狀藻體的藻紅蛋白含量。溫度對絲狀藻體藻紅蛋白含量大小具有最顯著的影響（P=3.564×10-5），其次是光照強度對絲狀藻體藻紅蛋白含量大小也有極顯著的影響（P=2.261×10-4），海水鹽度的影響也是顯著的（P=4.813×10-2）。分析結(jié)果還表明，溫度因子與光照強度或海水鹽度間的交互作用是顯著的（P分別為3.833×10-2和4.314×10-2），但光照強度與海水鹽度間不存在交互作用（P=0.469 8）。

方差分析結(jié)果表明了因子之間存在交互作用，即各因子水平之間存在交互效應(yīng)，因而考察絲狀藻體的藻紅蛋白含量對應(yīng)的各個因子間的交互作用情況、確定各個因子水平如何合理搭配，對于高含量藻紅蛋白絲狀藻體培養(yǎng)獲得是很重要的。由絲狀藻體藻紅蛋白含量兩因子間交互作用的分析結(jié)果（表4）可看出：溫度因子A和光照強度因子B的最佳搭配為A2B2（最大的搭配指標(biāo)值是53.02）；溫度因子A和鹽度因子C的最佳搭配是A2C1，2（最大的搭配指標(biāo)值為45.30和45.32，十分接近）；而光照強度因子B與鹽度因子C的最佳搭配是B2C2（此時最大的搭配指標(biāo)值為39.94）。因而，從有利絲狀藻體藻紅蛋白高含量指標(biāo)參數(shù)綜合考慮，最適宜的環(huán)境條件參數(shù)因子數(shù)值的搭配應(yīng)為A2B2C1，2，在這種優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的絲狀藻體可獲得最高含量的藻紅蛋白。

2.3 優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件的驗證

采用正交實驗獲得的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件，實施進一步的培養(yǎng)效果驗證，實施例證序號1～3的培養(yǎng)條件為溫度18℃，光強1 500 lx，鹽度20；實施例證序號4～5的培養(yǎng)條件為溫度18℃，光強1 500 lx，鹽度25。獲得的絲狀藻體藻紅蛋白含量結(jié)果見表5。由進一步具體實施例證的結(jié)果可看出：采用獲得的優(yōu)化條件，調(diào)控培養(yǎng)的絲狀藻體藻紅蛋白含量高，指標(biāo)參數(shù)值變動范圍介于53.28～64.73 mg/g.dw（平均值±SD為58.24±5.07 mg/g.dw），說明本實驗研究得出的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件能促進提高絲狀藻體的藻紅蛋白含量，而且效果比較穩(wěn)定。因而，采用優(yōu)化的調(diào)控培養(yǎng)條件，可以達到絲狀藻體藻紅蛋白含量高的良好效果，培養(yǎng)的絲狀藻體適宜作為分離提取制備藻紅蛋白的理想藻材料。

3 討論

正交實驗設(shè)計是研究多因子多水平效應(yīng)的常用實驗方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的實驗點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點，因而能達到高效、快速、經(jīng)濟的實驗效果，該方法在目標(biāo)物的制備生產(chǎn)、工藝參數(shù)條件優(yōu)化等方面都有廣泛的應(yīng)用［19-24］。本研究采用適宜的多因素多水平的正交試驗，通過對實驗結(jié)果的極差分析、方差分析以及不同因子水平的效果評價，確立了促進壇紫菜絲狀藻體達到高含量藻紅蛋白的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件，獲得了良好的效果，絲狀藻體藻紅蛋白含量最高達到64.73 mg/g.dw（平均值± SD為58.24±5.07 mg/g.dw）。通過設(shè)計適宜的正交實驗方法，考察紫菜絲狀藻體藻紅蛋白含量對多因子水平環(huán)境條件的響應(yīng)變化，確定出優(yōu)化的調(diào)控培養(yǎng)條件，從而提供絲狀藻體適宜的環(huán)境條件，達到藻紅蛋白含量高的效果，這對于藻類材料高效開發(fā)利用具有重要的應(yīng)用價值。

目前，國內(nèi)外尚無有關(guān)紫菜絲狀藻體藻紅蛋白含量的分析報道。一些研究者做了其他藻材料的藻紅蛋白含量的分析測定。徐燕等［25］的分析結(jié)果表明，壇紫菜綠色葉狀體藻紅蛋白含量低，僅為5.513 0± 1.049 6 mg/g.dw；陳昌生等［26］對壇紫菜人工雜交和選育的5個品系中藻紅蛋白含量為32.54～61.55 mg/g.dw；紀德華等［27］比較了福建沿海8個野生壇紫菜種群的藻膽蛋白含量，結(jié)果表明藻紅蛋白含量為19.56～29.49 mg/g.dw。有賀祐勝等［28］指出條斑紫菜藻紅蛋白含量占藻體干重的2.4%～3.5%；孫利芹等［29］研究了培養(yǎng)條件對紫球藻藻紅蛋白含量的影響，發(fā)現(xiàn)高光照有利于藻紅蛋白的積累，并且隨著光照強度的增加，藻體細胞藻紅蛋白的含量隨之增加，N營養(yǎng)鹽較高時，有利藻紅蛋白的積累，獲得的藻紅蛋白含量可達藻干重的5.3%～9.14%；李信書等［30］也發(fā)現(xiàn)，增加培養(yǎng)液中的N和P含量可以顯著提高條斑紫菜的藻紅蛋白的含量，藻紅蛋白含量為1.5～4.5 mg/g.dw；孟慶俊等［31］考察了營養(yǎng)鹽可得性對壇紫菜及藻紅蛋白含量的影響，藻紅蛋白含量為0.30～0.33 mg/g.fw；蔣雯雯等［32］研究了營養(yǎng)鹽濃度變化對2種菊花江蘺藻紅蛋白含量的影響，結(jié)果含量為2.0～7.5 mg/g.dw；ZHANG et al［33］分析了來自江蘇黃海不同地點3種品系的條斑紫菜的藻紅蛋白含量為5～7.5 mg/g.fw，并指出藻紅蛋白含量除與品系有關(guān)外，還與海區(qū)的溫度和光照有關(guān)。為了有利于藻紅蛋白分離提取的高效化，藻材料藻紅蛋白含量的大小至關(guān)重要。海洋藻類生物由于長久的進化歷程以及對環(huán)境的長期適應(yīng)性，不同的藻類對各種環(huán)境因子具有特殊的需求，因而應(yīng)針對不同的藻類，提供適宜的培養(yǎng)條件，才能有利藻生物累積更高含量的藻紅蛋白。與已報道的文獻相比較，本研究通過優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)的方法獲得的絲狀藻體具有更高的藻紅蛋白含量，體現(xiàn)了調(diào)控培養(yǎng)絲狀藻體在作為分離提取藻紅蛋白藻材料上具有明顯優(yōu)勢。另外，需要提及的是：在本文的調(diào)控培養(yǎng)實驗中所涉及的其他附帶固定培養(yǎng)條件，例如：海水p H值、添加復(fù)合維生素和Na HCO3、每天光照時數(shù)，提供充足的f/2營養(yǎng)鹽介質(zhì)，可能在一定程度上更有利于絲狀藻體藻紅蛋白成分的累積，達到良好的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)效果.

從海洋藻類中獲取高價值的天然活性產(chǎn)物是當(dāng)前海藻開發(fā)利用的熱點［1，4-5，34］，本研究表明，采用優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)方法可獲得高含量藻紅蛋白的絲狀藻體，該方法操作簡便易行，效果明顯，獲得的絲狀藻體除了具有藻紅蛋白含量高的特點外，還具有其他方面的優(yōu)點，例如，由于是采用人工優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)紫菜絲狀藻體，因而無需到現(xiàn)場海區(qū)獲取藻材料，有利保護自然海區(qū)的生態(tài)環(huán)境；而且藻材料的獲得可得到較可靠的保證，不受季節(jié)、時間等限制性條件的影響。此外，采用優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)的絲狀藻體具有細胞壁薄、藻紅蛋白含量高、干擾性物質(zhì)少、可形成藻絲絮團、采收方便等特點，對于進一步分離提取制備高純度藻紅蛋白目標(biāo)物十分有利，達到藻類材料高值化利用的目的，可為分離提取高純度藻紅蛋白提供良好的藻材料。

4 小結(jié)

絲狀藻體作為一種重要的藻材料，為了達到良好的培養(yǎng)效果，優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)技術(shù)至關(guān)重要。本研究考察了3個與紫菜絲狀藻體藻紅蛋白含量密切相關(guān)的外界條件因子，采用了適宜的多因子多水平的正交實驗，同時進行了相關(guān)的顯著性分析和驗證實驗，從而獲得具有顯著提高絲狀藻體藻紅蛋白含量的優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件是溫度18℃、光強1 500 lx、鹽度20或25。采用優(yōu)化的調(diào)控培養(yǎng)條件，有利于分離提取藻材料中含有的高價值天然活性產(chǎn)物，從而有望達到更顯著的經(jīng)濟效益。

（References）：

［1］GARCIA-CASAL M N，RAMIREZ J，LEETS I，et al.Antioxidant capacity，polyphenol content and iron bioavailability from algae（Ulva sp.，Sargassum sp.and Porphyra sp.）in human subjects［J］.British Journal of Nutrition，2009，101（1）：79-85.

［2］OSULLIVAN L，MURPHY B，MCLOUGHLIN P，et al.Prebiotics from marine macroalgae for human and animal health applications［J］.Marine Drugs，2010，8（7）：2 038-2 064.

［3］GUPTA S，ABU-GHANNAM N.Bioactive potential and possi-ble health effects of edible brown seaweeds［J］.Trends in Food Science&Technology，2011，22（6）：315-326.

［4］ZHANG Quan-bin，LI Ning，ZHOU Ge-fei，et al.In vivo antioxidant activity of polysaccharide fraction from Porphyra haitanesis（Rhodephyta）in aging mice［J］.Pharmacological Research，2003，48（2）：151-155.

［5］ZHANG Zhong-shan，ZHANG Quan-bin，WANG Jing，et al. Chemical modification and influence of function groups on the in vitro-antioxidant activities of porphyran from Porphyra haitanensis［J］.Carbohydrate Polymers，2010，79（2）：290-295.

［6］CHEN Mei-zhen，GE An-shan，YU Jie，et al.Influence of different treatment factors on antioxidative activities of the phycoerythrin from the Gracilaria lemaneiformis［J］.Journal of Shantou University：Natural Science Edition，2006，21（3）：6-11.

陳美珍，葛安山，余杰，等.處理因素對龍須菜藻紅蛋白抗氧化活性的影響［J］.汕頭大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2006，21（3）：6-11.

［7］FANG Yong，YANG Fang-mei，ZHAO Dian-feng，et al.Preparation of enzymatic hydrolysate of R-phycoerythrin from Porphyra yezoensis and its antioxidant and tumor cell proliferation inhibiting activities［J］.Scientia Agricultura Sinica，2012，45（15）：3 222-3 230.

方勇，楊方美，趙殿峰，等.條斑紫菜R-藻紅蛋白酶解物的制備及其抗氧化和腫瘤細胞增殖抑制活性［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（15）：3 222-3 230.

［8］CAI Chun-er，WU Qin-lei，XU Chun-he，et al.Advance of phycoerythrin as a photosensitizer［J］.Letters in Biotechnology，2004，15（6）：629-632.

蔡春爾，吳慶磊，徐春和，等.藻紅蛋白光敏劑研究進展［J］.生物技術(shù)通訊，2004，15（6）：629-632.

［9］LI Guan-wu，WANG Guang-ce，WEN Bo-gui，et al.Phycoerythrin as a novel photosensltlzer applied in the photodynamic therapy of cancer［J］.China Journal of Cancer Prevention and Treatment，2001，8（4）：353-355.

李冠武，王廣策，溫博貴，等.藻紅蛋白應(yīng)用于腫瘤光動力治療的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2001，8（4）：353-355.

［10］GUO Lei，WANG Shu-jun，HAO Qian，et al.Advances in the biological functions of polysaccharide and phycoerythrin in Porphyra［J］. Food Research and Development，2010，31（6）：182-185.

郭雷，王淑軍，郝倩，等.紫菜多糖和藻紅蛋白生物活性的研究進展［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31（6）：182-185.

［11］GUO Zi-ye，CAI Chun-er，LI Chun-xia，et al.Pilot preparation and optical properties of highly purified phycoerythrin from Porphyra yezoensis［J］.Biotechnology Bulletin，2013（3）：192-198.

郭子葉，蔡春爾，李春霞，等.條斑紫菜高純度藻紅蛋白規(guī)模制備及光學(xué)性質(zhì)研究［J］.生物技術(shù)通報，2013（3）：192-198.

［12］VERNON T，ALEXANDER O I，GLAZER N，et al.Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules［J］.Journal of Cell Biology，1982，93（6）：981-986.

［13］MA Sheng-yuan，WANG Guang-ce，SUN Hai-bao，et al.Characterization of the artificially covalent conjugate of B-phycoerythrin and R-phycocyanin and the phycobilisome from Porphyridium cruentum［J］.Plant Science，2003，164（2）：253-257.

［14］MAHMOUDIAN J，JEDDI-TEHRANI M，RABBANI H，et al.Conjugation of R-phycoerythrin to a polyclonal antibody and F（ab＇）2 fragment of a polyclonal antibody by two different methods［J］.Avicenna Journal of Medical Biotechnology，2010，2（2）：87-91.

［15］ZHOU Ming，CAI Chun-er，LIU Jun-xiu，et al.Optimization of Ig G conjugation with R-phycoerythrin from Porphyra yezoensis［J］.Journal of Applied Phycology，2010，22（4）：459-464.

［16］LIU Ting，SHEN Jian-dong，LIU Guang-ming，et al.Preparation of R-phycoerythrin from red alga and its application for antibody labeling and detection［J］.Science and Technology of Food Industry，2012，33（17）：147-150.

劉婷，沈建東，劉光明，等.紅毛藻R-藻紅蛋白的高效制備以及抗體標(biāo)記與檢測［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（17）：147-150.

［17］YAN Shi-gan，ZHU Li-ping，ZHANG Yu-zhong，et al.Preparation of phycoerythrin-labelled anti-avian-Ig G-antibody［J］.Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2009，31（2）：127-131.顏世敢，朱麗萍，張玉忠，等.藻紅蛋白標(biāo)記抗雞IgG熒光抗體的高效制備［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，31（2）：127-131.

［18］SAMPATH-WILEY P，NEEFUSC D.An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra（Bangiales，Rhodophyta）［J］.Journal of Applied Phycology，2007，19（2）：123-129.

［19］HUANG Rong-zi，WAN Jin-quan，MA Yong-wen，et al.Optimization of synthetic culture condition of cellulase producing strains using orthogonal experimental design［J］.China Environmental Science，2012，32（1）：130-135.

黃蓉姿，萬金泉，馬邕文，等.正交實驗選擇纖維素酶產(chǎn)生菌的最優(yōu)綜合培養(yǎng)條件［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2012，32（1）：130-135.

［20］ZHANG Jing-jing，LIU Qiu-feng，WU Cheng-ye.Extraction technology optimization of polysaccharides from Grateloupia filicina［J］.Journal of Fujian Fisheries，2013，35（4）：290-295.

張婧婧，劉秋鳳，吳成業(yè).蜈蚣藻多糖提取工藝優(yōu)化［J］.福建水產(chǎn)，2013，35（4）：290-295.

［21］ZHOU Wei，SUI Zheng-hong，WANG Jing-guo，et al.An orthogonal design for optimization of growth conditions for all life history stages of Gracilariopsis lemaneiformis（Rhodophyta）［J］.Aquaculture，2013，392（10）：98-105.

［22］WEI Li-kun，HUANG Xu-xiong，HUANG Zhen-zheng，et al. Orthogonal test design for optimization of lipid accumulation and lipid property in Nannochloropsis oculata for biodiesel production［J］.Bioresource Technology， ，147（11）：534-538.

［23］MOHAN S V，REDDY M V.Optimization of critical factors to enhance polyhydroxyalkanoates（PHA）synthesis by mixed culture using Taguchi design of experimental methodology［J］. Bioresource Technology，2013，128（1）：409-416.

［24］ABU-REZQ T S，AL-HOOTI S，JACOB D A J.Optimum culture conditions required for the locally isolated Dunaliella salina［J］.J Algal Biomass Utln，2010，1（2）：12-19.

［25］XU Yan，XIE Chao-tian，JI De-hua，et al.Isolation and characterization of strain crossbred pigmentation mutants in Porphyra haitanensis［J］.Journal of Fishery Sciences of China，2007，14（3）：466-471.

徐燕，謝潮添，紀德華，等.壇紫菜品系間雜交分離色素突變體及其特性的初步研究［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2007，14（3）：466-471.

［26］CHEN Chang-sheng，LIANG Yan，XU Yan，et al.Selective breeding and comparison of economic traits of the new thin-thallus strain Porphyra haitanensis［J］.Progress in Fishery Sciences，2009，30（2）：100-105.

陳昌生，梁艷，徐燕，等.壇紫菜薄葉新品系選育及經(jīng)濟性狀的比較［J］.漁業(yè)科學(xué)進展，2009，30（2）：100-105.

［27］JI De-hua，XIE Chao-tian，SHI Xiu-zhou，et al.Analysis of the major quality traits in wild Porphyra haitanensis of Fujian coast［J］.Journal of Jimei University：Natural Science，2011，16（6）：401-406.

紀德華，謝潮添，史修周，等.福建沿海野生壇紫菜主要品質(zhì)性狀分析［J］.集美大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011，16（6）：401-406.

［28］YOUHE You-sheng.Culture and pigment of Porphyra yezoensis［J］.Foreign Fishery，1982（4）：8-13.

有賀祐勝.條斑紫菜（Porphyra yezoensis）的顏色和色素［J］.國外水產(chǎn)，1982（4）：8-13.

［29］SUN Li-qin，WANG Chang-hai，TENG Li.Effect of culture conditions on the content of B-phycoerythrins in Porphyridium cruentum cells［J］.Journal of Zhejiang University：Agriculture &Life Sciences Edition，2007，33（1）：40-44.

孫利芹，王長海，滕立.培養(yǎng)條件對紫球藻B-藻紅蛋白含量的影響［J］.浙江大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2007，33（1）：40-44.

［30］LI Xin-shu，F(xiàn)U Guang-hui，CHEN Bai-yao，et al.Effects of nitrogen and phosphorus enrichment on growth and biochemical composition of laver Porphyra yezoensis［J］.Fisheries Science，2012，31（9）：544-548.

李信書，伏光輝，陳百堯，等.氮、磷加富對條斑紫菜生長及生化組成的影響［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2012，31（9）：544-548.

［31］MENG Qing-jun，LIN Shao-zhen，XIANG Bin-bin，et al.Effect of nutrient availability on nitrogen and phosphorus uptake rate，growth rate and the content of phycoerythrin in Porphyra haitanensis［J］. Journal of Shanghai Ocean University，2010，19（2）：214-218.

孟慶俊，林少珍，項彬彬，等.營養(yǎng)鹽可得性對壇紫菜氮磷吸收、生長及藻紅蛋白含量的影響［J］.上海海洋大學(xué)學(xué)報，2010，19（2）：214-218.

［32］JIANG Wen-Wen，TIAN Xiang-Li，DONG Shuang-Lin，et al. Effects of nutrient concentration changes on growth，biochemical compositions and physiology of G racilaria lichenoides and G.tenuistipitata var.liui［J］.Periodical of Ocean University of China，2010，40（Sup.）：83-90.

蔣雯雯，田相利，董雙林，等.營養(yǎng)鹽濃度變動對菊花江蘺和細基江蘺繁枝變型生長、生化組成及生理的影響研究［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報，2010，40（增刊）：83-90.

［33］ZHANG Tao，SHEN Zong-gen，XU Pu，et al.Analysis of photosynthetic pigments and chlorophyll fluorescence characteristics of different strains of Porphyra yezoensis［J］.Journal of Applied Phycology，2012，24（4）：881-886.

Optimal culture conditions for Porphyra haitanensis conchocelis with high content of phycoerythrin based on the orthogonal experimentation

LIN Ru-rong1，2，XING Bing-peng1，2，KE Xiu-rong1，2，CAI Wen-xuan1，2，LIN Xi-huang1，2，ZHANG Zhi-lan1，2
（1.Key Laboratory of Global Change and Marine-Atmospheric Chemistry，Xiamen 361005，China：2.Third Institute of Oceanography，SOA，Xiamen 361005，China）

The conchocelis is very important for artificial seeding production in Porphyra cultivation and can be potentially used for separation and extraction of high value phycoerythrin.We investigated several influential factors related to phycoerythrin content of Porphyra haitanensis conchocelis and studied the optimal controlled culture conditions under which high content of phycoerythrin was obtained.Specific operational processes：initial conchocelis was obtained from carpospores release of mature Porphyra thallus and responses of conchocelis phycoerythrin content to environmental factors and optimal controlled culture conditions were determined based on the designation of an orthogonal experimentation with interactional analysis of three factors and three levels［L27（313）］.Results demonstrate that factors of temperature，light intensity and salinity have significant effects on phycoerythrin content（P≤0.048 1）.There are factorial interaction occurrences between temperature and light intensity or salinity（P≤0.043 1）.However there is no significant interaction between light intensity and salinity（P=0.469 8）.The optimal controlled culture conditions for high content of phycoerythrin are：temperature 18℃、light intensity 1 500 lx and salinity 20 or 25.Under optimal controlled culture condition，conchocelis phycoerythrin content is as high as 64.73 mg/g.dw（average±SD：58.24±5.07 mg/g.dw）.

Porphyra haitanensis；conchocelis；phycoerythrin；orthogonal experimentation；temperature；light intensity；salinity

S968.43+1；Q946.1

A

1001-909X（2014）02-0067-07

10.3969/j.issn.1001-909X.2014.02.009

林汝榕，邢炳鵬，柯秀蓉，等.基于正交實驗的高含量藻紅蛋白紫菜絲狀藻體優(yōu)化調(diào)控培養(yǎng)條件研究［J］.海洋學(xué)研究，2014，32（2）：67-73，

10.3969/j.issn.1001-909X.2014.02.009.

LIN Ru-rong，XING Bing-peng，KE Xiu-rong，et al.Optimal culture conditions for Porphyra haitanensis conchocelis with high content of phycoerythrin based on the orthogonal experimentation［J］.Journal of Marine Sciences，2014，32（2）：67-73，doi：10. 3969/j.issn.1001-909X.2014.02.009.

2014-02-19…………

2014-03-10

廈門市海洋生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化中試研發(fā)基地建設(shè)平臺項目資助（3502Z20111001-5）

林汝榕（1956-），男，福建龍巖市人，研究員，博士，主要從事海洋藻類資源開發(fā)與利用方面的研究。E-mail：linrulong2010@163.com