張 勇，趙 鑫，賈衛(wèi)茹

0 引言

聚山梨酯80是一種穩(wěn)定的非離子型表面活性劑、乳化劑、增溶劑、潤濕劑、分散劑和助懸劑，在醫(yī)藥領(lǐng)域中廣泛使用[1-10]。由于聚山梨酯具有較強的親水性和化學上的不解離性，對親脂性藥物有較好的助溶作用，能與許多中藥成分配伍，因此在中藥注射劑中，常添加聚山梨酯80以增加有效成分的溶解度。其增溶效果好、乳化能力強，藥物不易析出，在水包油(O/W)型乳化劑中，能使其他物質(zhì)在溶液中均勻分散，形成穩(wěn)定的乳劑。

近年來，聚山梨酯80的安全性愈發(fā)受到關(guān)注[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)高濃度時其具有一定的溶血性，且溶血性受產(chǎn)品合成工藝影響，不同工藝及純化工藝制得的產(chǎn)品差異很大，優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品在正常使用量不會產(chǎn)生溶血作用[13-15]。對犬進行的藥理研究發(fā)現(xiàn)，其具有促進組胺釋放的作用,聚山梨酯80的類過敏反應有明顯的種屬差異，犬對其過敏反應比較敏感，猴對其過敏反應不太敏感，食蟹猴后肢靜脈注射5%的聚山梨酯80注射液(劑量為50 mg/kg)，進口和國產(chǎn)的聚山梨酯80都未發(fā)現(xiàn)有過敏反應[16-21]。

聚山梨酯80是由油酸山梨坦和環(huán)氧乙烷聚合而成的。其結(jié)構(gòu)中存在3個支鏈，每個支鏈中聚乙氧基(-CH2CH2O-)的數(shù)量不同，但整個分子中聚乙氧基(-CH2CH2O-)的數(shù)量為20，使其性質(zhì)存在差別，但其分子量恒定。結(jié)構(gòu)中含有油酸，可以水解產(chǎn)生油酸。分子中不存在共軛雙鍵，故僅有末端的紫外吸收。

由于聚山梨酯80自身的組成成分比較復雜[22-23]，其安全性與用量成為影響藥品安全性的關(guān)鍵，藥品標準中未形成其檢驗方法，使得其檢驗方法成為關(guān)鍵,尤其在制劑及體內(nèi)的檢驗方法成為研究的重點，本文對國內(nèi)外聚山梨酯80的檢驗方法經(jīng)行了總結(jié)。

1 聚山梨酯80的鑒別

利用聚乙氧基能夠與硫氰酸鈷銨形成藍色聚合物，該聚合物能夠溶解于氯仿，使氯仿層顯色的原理測定。閆位娟等[24]研究了中藥注射液中聚山梨酯80的鑒別方法，對42種常見注射液進行研究，采用供試液加硫氰酸鈷銨溶液2 mL，搖勻，加1 mL氯仿?lián)u勻，靜置1.5 h，觀察氯仿層顏色。由于中藥注射液中成分復雜，會有干擾。氯仿層出現(xiàn)藍色為陽性，淺藍色為弱陽性，綠色為可疑，其他顏色均記為陰性。

2 聚山梨酯80的定量

2.1 分光光度法 閆位娟等[24-25]利用聚山梨酯80與硫氰酸鈷銨反應顯色原理，采用分光光度法測定其含量。取聚山梨酯80 制成系列濃度的對照溶液，顯色，測定吸光度，建立標準曲線，供試品與硫氰酸鈷銨溶液顯色后，測定。當硫氰酸鈷銨用量足夠時，供試品溶液吸光度不會隨硫氰酸鈷銨用量增加而改變。樣品顯色后，吸光度穩(wěn)定，由于中藥注射液中其他成分影響，測定波長會有差異。劉燕梅等[26]采用本方法測定了4家企業(yè)的12批魚腥草注射液及8家企業(yè)的香丹注射液，能夠準確測定其中的聚山梨酯80的含量。

2.2 水解法 根據(jù)聚山梨酯80結(jié)構(gòu)特點，其結(jié)構(gòu)中含有油酸，利用在堿性條件下水解的方法，水解出油酸，聚山梨酯80與水解產(chǎn)物油酸的比例為1∶1。利用高效液相色譜法測定水解產(chǎn)生的油酸，計算出聚山梨酯80的含量。Michael等[27-28]取生物樣品300 μL，加入300 mmol/L的氫氧化鈉溶液300 μL，60 ℃放置18 h，進行水解。冷卻至室溫，加5 mol/L的氫氧化鈉溶液150 μL和乙腈600 μL，5 mol/L的氫氧化鈉溶液用來使乙腈-水溶液分層。取乙腈層200 μL，加入20 mmol/L磷酸鉀50 μL作為供試品溶液。同法制備對照品溶液。色譜條件為ODS柱(3.9 mm×150 mm，5 μm)，流動相為乙腈-20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8)，檢測波長為195 nm，流速1 mL/min。該方法使水解后產(chǎn)生的油酸萃取至乙腈層，消除了蛋白對測定的影響，在蛋白濃度高至75 mg/mL仍可準確定量。

李建偉等[29]取復方苦參注射液樣品2 mL，放入烘箱中烘干后(105 ℃，2～3 h)，依次加入2%(w/v)氫氧化鈉甲醇溶液2 mL，水浴回流30 min，14%(w/v)三氟化硼-甲醇溶液2 mL，水浴回流30 min，正庚烷5 mL回流5 min，放冷，加飽和氯化鈉溶液10.0 mL，振搖15 s，移取正庚烷層(上層)，水洗，加適量無水硫酸鈉脫水，得供試品溶液，用氣相色譜法測定聚山梨酯80的含量。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜連用法 Baker等[30-31]采用液質(zhì)聯(lián)用色譜法測定血樣中聚山梨酯80，樣品經(jīng)純化后，色譜分離，質(zhì)譜檢測。方法是取1 mL樣品于裝有7 mL乙腈-正丁基氯(1∶4)的培養(yǎng)管(16×125 mm)中，加入紫杉醇甲醇溶液10 μL(0.01 mM)作為內(nèi)標。渦旋混合10 s，震蕩5 min。室溫離心10 min，取上層有機相轉(zhuǎn)移至硼硅酸鹽玻璃培養(yǎng)管(13×100 mm)，在60 ℃氮氣吹干，殘渣加甲醇-水(1∶1)100 μL，渦旋10 s，超聲5 min，再離心8 min，取10 μL注入液相色譜儀。色譜條件為ODS柱(50 mm×2.1 mm，3.5 μm)，柱溫40 ℃，流動相為甲醇-水(9∶1)(加0.1%甲酸)，流速0.15 mL/min，質(zhì)譜采用正離子模式，碰撞能量35 eV，錐孔電壓38 V，聚山梨酯80在一級質(zhì)譜母離子m/z為1 309.8，子離子m/z為419.4；內(nèi)標物紫杉醇在一級質(zhì)譜母離子m/z為854.9，子離子m/z為419.4。碰撞氣為氬氣，壓力為0.002 7 mBar，每個通道的駐留時間為0.3 s。

2.4 液相色譜-蒸發(fā)光散色檢測器法 蒸發(fā)光散色檢測器能檢測不含發(fā)色團的化合物，為質(zhì)量型檢測器。Lakshmy等[32]采用C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，Alltech ELSD2000型檢測器，漂移管溫度40 ℃，氮氣流速1.5 L/min，流動相為甲醇-水，采用梯度洗脫方式，0～4 min，甲醇30%～90%；4～12 min，甲醇90%～30%。流速1.0 mL/min。該條件下，樣品不需要前處理，可以直接進樣，聚山梨酯80表現(xiàn)為單峰，保留時間短。

吳曉燕等[33]采用GF250 柱(250 mm×9.4 mm，4 μm)，柱溫:30 ℃，流動相為20 mmol/L醋酸銨溶液-乙腈(90∶10)，流速0.6 mL/min，漂移管溫度110 ℃，空氣流速2.3 L/min。進行了79批樣品的檢驗，方法準確可靠。

Vikram等[34]采用Waters生產(chǎn)的Oasis HLB固相提取小柱先對樣品進行凈化，然后采用液相色譜儀進行測定。固相提取小柱用1 mL乙腈洗2次，用1 mL水洗1次，加樣品1 mL，抽干溶液，用1 mL水洗脫2次，洗脫液收集至一個新的小柱上，加0.5 mL乙腈，抽干，盡可能收集洗脫液作為供試品溶液。采用ODS-3(C18)(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相為乙腈-水，梯度洗脫，0～5 min，乙腈為0%；5～6 min，乙腈為0%～60%；6～8 min，乙腈為60%～80%，并保持5 min；隨后乙腈為0%至平衡。該方法的色譜圖中聚山梨酯80的峰型好，分析時間合適。

2.5 凝膠色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法 凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法，是根據(jù)分子大小進行分離，有利于聚山梨酯80這種大分子與其他藥物分離。尹利輝等[35]采用凝膠色譜柱(8.7×30.0 cm)，柱溫30 ℃，流動相為0.02 mol/L醋酸銨溶液-乙腈(90∶10)，流速0.6 mL/min，Alltech ELSD2000ES型檢測器，漂移管溫度110 ℃，氮氣流速2.3 L/min。測定了19種78批中藥注射液樣品，聚山梨酯80與其他物質(zhì)分離良好。對6種中藥注射液進行回收率實驗，回收率在93.8%～99.2%之間。李櫻紅等[36]測定79批冠心寧注射液中聚山梨酯80的含量，吳毅等[37]測定魚腥草注射液、新魚腥草鈉注射液、柴胡注射液中聚山梨酯80的含量，唐登峰等[38]測定8家企業(yè)30批莪術(shù)油注射液中聚山梨酯80的含量，高文分等[39]測定醒腦靜注射液中聚山梨酯80的含量，董媛等[40]測定了247批次血塞通注射液和141批次燈盞花素注射液，曹靜等[41]測定生脈注射液中聚山梨酯80含量，趙輝等[42]測定重組人干擾素α2b注射液中吐溫80的含量，證明方法準確可靠。

3 展望

3.1 國產(chǎn)聚山梨酯80現(xiàn)狀 美國FDA批準的用量顯示，靜脈注射的給藥途徑時，注射液中吐溫80最大允許用量為10%，凍干粉中吐溫80可以加至制劑總重量的12%。可見聚山梨酯80在國外被認為高安全性的藥用輔料。這是基于國外聚山梨酯80的產(chǎn)品質(zhì)量高，性能安全穩(wěn)定的前提下。我國的聚山梨酯80產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，不同時期的產(chǎn)品質(zhì)量差異很大，與進口產(chǎn)品質(zhì)量相比仍有較大差距[43]。郭志鑫等[44]對10家生產(chǎn)企業(yè)的21個批次產(chǎn)品進行質(zhì)量分析，注射劑廠家提供的吐溫80，均是在2010年版藥典執(zhí)行前生產(chǎn)，按照2005年版藥典檢測，有一批不合格，不合格項目為粘度和酸值，總體不合格率為5%。但是按照2010年版藥典，不合格的批數(shù)已經(jīng)上升到62%，其不合格項為環(huán)氧乙烷和過氧化值，不合格率分別為38%和57%。孫會敏等[45]對全國5個省市7家企業(yè)的18批吐溫80進行質(zhì)量分析，按照2005年版藥典全部產(chǎn)品都合格，但是按照2010年版藥典檢測，總體不合格率升高至62%。在對現(xiàn)有產(chǎn)品雙氧水檢查中發(fā)現(xiàn)，7家企業(yè)的產(chǎn)品中均檢測出殘留，雙氧水含量高的吐溫80靜脈注射后，Beagle犬類過敏反應也高。現(xiàn)實情況是我國制藥企業(yè)大量采購進口的注射級聚山梨酯80來滿足生產(chǎn)需求。

3.2 檢驗方法選擇 聚山梨酯80作為增溶劑、乳化劑在注射液中使用廣泛，使許多水溶性差的藥物具有廣闊的開發(fā)前景。隨著人們對于藥用輔料的研究深入，其安全性備受關(guān)注。使其在藥品中的用量成為檢測的重點。迫切需要一種簡便，準確的方法測定其含量。隨著檢測技術(shù)的不斷提高，根據(jù)樣品的特點，選擇合適的檢測方法測定其含量成為現(xiàn)實。制劑中的聚山梨酯80建議采用凝膠色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法，該方法經(jīng)過多種制劑檢驗驗證，方法準確可靠，便于操作。由于聚山梨酯80分子量為1 309.8，具有長鏈結(jié)構(gòu)，屬于大分子，藥物分子一般都屬于小分子，易于分離。通過凝膠色譜分離，能夠控制產(chǎn)品分子量分布，分子量分布范圍低的產(chǎn)品質(zhì)量更加可靠，安全性高[44]。對于生物樣品，可以采用固相萃取法或液-液萃取法去除蛋白質(zhì)，再經(jīng)過色譜分離，然后再利用質(zhì)譜的高靈敏度進行檢測。質(zhì)譜具有高分辨率，能夠?qū)⒉煌|(zhì)荷比的物質(zhì)分別測量，同時測量多種物質(zhì)，定性定量準確。

3.3 質(zhì)量控制要點 在提高聚山梨酯80的含量的同時，更應將質(zhì)量控制的重點放在相關(guān)的雜質(zhì)檢測上，聚山梨酯80本身雖然具有一定的藥理活性，但是其本身的活性不及雜質(zhì)的活性，雜質(zhì)的活性是其產(chǎn)生不良反應的主要原因，應重點進行監(jiān)控，對于購入的聚山梨酯80輔料，應嚴格按照現(xiàn)行藥典標準進行檢驗，并增加脂肪酸組成檢查[46-47],雙氧水檢查[48-50]及殘留溶劑檢查[51]，脂肪酸復雜的產(chǎn)品一般是由于使用的原料油酸純度不夠高，為了使產(chǎn)品顏色符合規(guī)定，需要添加雙氧水除色，造成雙氧水殘留。在進行制劑生產(chǎn)前嚴格控制其質(zhì)量，以降低不良反應發(fā)生的概率，將用藥風險控制在生產(chǎn)前。

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