甘自立,朱瑞杰,朱會珍綜述,林紅審校

(1、東華理工大學(xué)校醫(yī)院,江西南昌330006;2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科,江西南昌330006)

NF-κB信號通路在宮頸癌中的研究進展

甘自立1,朱瑞杰1,朱會珍1綜述,林紅2審校

(1、東華理工大學(xué)校醫(yī)院,江西南昌330006;2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科,江西南昌330006)

宮頸癌是危害女性健康的第二大惡性腫瘤,化療在宮頸癌治療中占據(jù)重要位置,但是腫瘤耐藥性和腫瘤負荷增加最終導(dǎo)致化療效果不佳.研究發(fā)現(xiàn),腫瘤放化療中NF-κB活化可能是腫瘤有效治療的障礙,以NF-κB為分子標靶探討其活性調(diào)控對腫瘤增殖與凋亡及化療敏感性的影響是近年研究熱點.本文就其在宮頸癌中的研究進展作一綜述.

宮頸癌;NF-κB;信號通路

1 NF-κB家族的組成和生物學(xué)特點

NF-κB信號傳導(dǎo)通路的激活,主要有兩條途徑,分別是經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑,主要涉及NF-κB抑制劑,IκB激酶,IκB和NF-κB家族成員[1]. NF-κB家族由p65,p50,p52,RelB,c-Rel五個成員構(gòu)成,它們分別由RelA,NF-κB1,NF-κB2, RelB,c-Rel五個基因進行編碼.根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能和合成方式的不同,Rel蛋白分為兩組[2]:第一組包括NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52),分別由其蛋白前體pl00和p105裂解而來,與本家族的其它成員結(jié)合成二聚體存留于胞漿,它們都包含有DNA結(jié)合區(qū),但缺少轉(zhuǎn)錄活性區(qū)(TAD).第二組包括RelA, RelB,c-Rel,它們沒有前體,除有RHD外,還有一個或多個轉(zhuǎn)錄活性區(qū)-TAD,對基因表達起正向調(diào)節(jié)作用.上述兩組蛋白成員間可形成同源或異源二聚體[3].不同的Rel/NF-κB蛋白二聚體具有不同的結(jié)合序列(κB位點),因而具有各自的特性.絕大多數(shù)NF-κB蛋白(p50、p65、c-Rel、p52、c-Rel-p65)是轉(zhuǎn)錄激活的復(fù)合體,但p50同源二聚體和p52同源二聚體則是轉(zhuǎn)錄抑制的復(fù)合體.最常見的二聚體是p50-p65異源二聚體,也稱NF-κB.

2 NF-κB的激活

NF-κB的激活機制是一個復(fù)雜的過程,尚未完全闡明.在大多數(shù)細胞中,Rel/NF-κB通過與抑制蛋白IκB直接結(jié)合形成無活性的三聚體存留于胞漿.NF-κB活化發(fā)生核易位時,首先需要抑制蛋白IκB的解離,胞外各種刺激的信號傳遞過程中,經(jīng)過一系列酶激活,致使IκB降解,NF-κB二聚體發(fā)生核易位,從而調(diào)控相應(yīng)基因的表達,這就是NF-κB的經(jīng)典途徑.靜息狀態(tài)下,NF-κB以非活性狀態(tài)與IκBs結(jié)合存在于胞質(zhì)中,不具備調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄能力.當細胞受到刺激時,刺激物通過特定信號通路激活I(lǐng)KBs激酶(IKK)復(fù)合物,引起IκBα氨基末端的32和36位的絲氨酸殘基磷酸化,使其泛素化并被蛋白酶體降解,釋放的NF-κB可轉(zhuǎn)移到核內(nèi),與NF-κB依賴基因結(jié)合,調(diào)節(jié)特定的基因表達.IκB磷酸化和降解是活化的關(guān)鍵步驟,其中Bcl-3不能使NF-κB產(chǎn)生胞質(zhì)阻滯,而只是作為p50和p52同源二聚體轉(zhuǎn)錄協(xié)同者在核內(nèi)正性調(diào)節(jié)基因表達.

3 NF-κB在宮頸癌發(fā)展中的作用

3.1 NF-κB在宮頸癌中的激活近年研究發(fā)現(xiàn),在人乳腺癌[4]、膀胱癌[5]和胃癌[6]等多種腫瘤中有NF-κB持續(xù)活化的現(xiàn)象.已有研究表明宮頸癌中存在NF-κB的組成式激活.程大麗[7]等以125例不同組織學(xué)分級的人類宮頸癌組織標本為實驗對象,應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫印跡方法檢測NF-κB(p65)蛋白在不同組織學(xué)分級標本中的表達水平,結(jié)果顯示在正常宮頸組織及輕度宮頸上皮內(nèi)非典型增生組織中,RelA主要定位于胞漿,而在重度宮頸上皮內(nèi)非典型增生及宮頸鱗狀細胞癌中,RelA主要位于胞核中.免疫印記方法的結(jié)果與免疫組織化學(xué)的結(jié)果相同.Venkatraman[8]等在未處理的SiHa細胞檢測到NF-κB活性的增加.Prusty[9]等研究結(jié)果顯示,宮頸鱗癌中存在NF-κB組成性激活,并以p50/p50同源二聚體為主.在宮頸癌中NF-κB組成性激活的存在說明NF-κB有可能在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中起作用.

3.2 NF-κB與HPV HPV感染是宮頸癌及癌前病變的主要原因之一.已有研究顯示,在HPV長控制區(qū)存在功能性的NF-κB位點,NF-κB與之結(jié)合后發(fā)揮抑制長控制區(qū)的抑制HPV轉(zhuǎn)錄的功能.其中, HPVE6、E7蛋白是HPV的兩個主要癌蛋白,它們通過操控宿主重要調(diào)節(jié)蛋白的功能來促進增殖. Dimitry[3]的研究表明,E7蛋白片段與IκB激酶復(fù)合物相結(jié)合并減弱IKKα,IKKβ的激酶誘導(dǎo)活性,因此導(dǎo)致IκBα的磷酸化和降解.間接免疫熒光法提示E7蛋白影響TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位,從而使得NF-κB不與它的同源DNA結(jié)合.HPV癌基因介導(dǎo)的NF-κB活性的抑制,使得HPV逃離了免疫系統(tǒng)的監(jiān)視,促進了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展.

Nees[10]等體外培養(yǎng)感染逆轉(zhuǎn)錄病毒(HPVE6和E7)的宮頸角質(zhì)化細胞,RT-PCR方法顯示宮頸角質(zhì)化細胞受TNF刺激后,E6和E7蛋白可以刺激多種與NF-κB激活相關(guān)的基因表達.免疫印跡方法顯示,RelA蛋白表達增加;EMSA方法顯示,E6蛋白明顯增加NF-κB DNA結(jié)合活性;cDNA微點陣方法的數(shù)據(jù)顯示,E6表達誘導(dǎo)NF-κB反應(yīng)性基因的表達.結(jié)果表明,HPV E6和E7蛋白在人宮頸角質(zhì)化細胞可增加NF-κB活性進而上調(diào)一些NF-κB反應(yīng)性基因.

James[11]等人的研究指出HPV E6蛋白以依賴PDZ結(jié)構(gòu)域的方式誘導(dǎo)含有p52的NF-κB二聚體與NF-κB結(jié)合位點結(jié)合,促進NF-κB效應(yīng)啟動子的活性,上調(diào)NF-κB效應(yīng)基因cIAP2(抑制凋亡基因)的表達.不僅如此,E6通過誘導(dǎo)TNF以及PDZ結(jié)構(gòu)域的存在來引起凋亡耐受.研究NF-κB和HPV的關(guān)系,對探討該病毒在腫瘤中的發(fā)病機制和疾病的預(yù)防治療有很大意義.但是目前HPV癌蛋白激活的是NF-κB具體哪個部分、E6和E7哪個更重要、NF-κB激活和E6已知功能間的關(guān)聯(lián)以及如何調(diào)整NF-κB依賴基因方面尚待進一步研究.

3.3 NF-κB與凋亡大量研究表明,活化的NF-κB在細胞凋亡中具有抗凋亡和促凋亡的雙重作用. Chen[12]等研究發(fā)現(xiàn),NF-κB亞單位的種類及數(shù)量在細胞凋亡中起著決定性的作用,當RelA(p65)過表達時發(fā)生凋亡抑制;當c-Rel表達增加時,則促進凋亡的發(fā)生.這些研究結(jié)果表明,NF-κB在細胞凋亡中是起抑制凋亡還是促進凋亡作用取決于不同的刺激因素及細胞類型,并與激活的NF-κB亞單位的種類及數(shù)量有關(guān),其具體機制有待進一步的研究.與宮頸癌有關(guān)研究指出:NF-κB的作用主要是抗細胞凋亡和保護細胞,NF-κB的抗凋亡作用主要是通過調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)的.NF-κB活化能上調(diào)凋亡蛋白抑制劑(IAPs)[13]和抗凋亡Bcl-2 家族成員的表達[14],從而抑制細胞凋亡.

腫瘤抑制因子p53通過促進細胞周期阻滯及細胞凋亡來抑制細胞生長,大部分腫瘤中存在p53的突變及缺失.Kevin[15]等人的研究指出NF-κB信號通路與p53誘導(dǎo)的細胞凋亡相關(guān).他們通過構(gòu)建p53誘導(dǎo)型Saos-2細胞(不表達內(nèi)源性p53的腫瘤細胞株),這些細胞中發(fā)生了廣泛的細胞程序性死亡,同時利用EMSA的方法檢測出NF-κB DNA結(jié)合活性也明顯升高,說明NF-κB參與了p53誘導(dǎo)的凋亡.在宮頸癌Hela細胞中,經(jīng)低劑量γ射線照射后,NF-κB活化引起細胞中SOD表達改變能抵抗由順鉑誘導(dǎo)的細胞凋亡.因此近年來,作為腫瘤新的治療靶點,NF-κB已成為新的研究熱點,其具體機制尚在探討中.

4 NF-κB在宮頸癌治療中的作用

4.1 NF-κB對放化療的影響NF-κB不僅在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起到分子開關(guān)作用,同時也能影響宮頸癌細胞的遷移和侵襲,從而影響宮頸癌治療的有效性.腫瘤細胞的遷移是引起治療失敗的主要原因,而NF-κB信號通路在其中起到關(guān)鍵作用.在郭菲[16]等人的研究中,利用氯化鑭(一種稀土化合物)處理的人宮頸癌細胞,進行免疫蛋白印記和NF-κB-DNA結(jié)合活性試驗分析NF-κB活性的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB(p65)蛋白的表達顯著降低,受其調(diào)控的MMP-1和MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶)表達也明顯下調(diào),說明了氯化鑭通過抑制NF-κB信號通路明顯抑制了人宮頸癌Hela細胞的遷移和侵襲,從而提高了治療的成功率.

染料木黃酮作為一種酪氨酸蛋白酶抑制劑,與化療聯(lián)用可以增加宮頸癌對順鉑的敏感性, Sahin[17]等人的研究發(fā)現(xiàn)25μmol的染料木黃酮聯(lián)合250nM的順鉑可以明顯的抑制細胞生長,利用免疫印跡實驗分別檢測NF-κB(p65)蛋白在順鉑組、染料木黃酮組、兩藥聯(lián)合組的Hela細胞中的表達水平.結(jié)果顯示,與對照組相比,順鉑組處理后的Hela細胞NF-κB(p65)蛋白的表達水平上調(diào)了1.5倍,染料木黃酮組的Hela細胞NF-κB(p65)蛋白的表達水平下降了75%,兩藥聯(lián)合組NF-κB(p65)蛋白的表達水平下降了80%,說明抑制NF-κB(p65)蛋白的表達可以明顯改善因順鉑引起的化療耐受.

國內(nèi)邢麗娜[18]等人的研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌HeLa細胞中,NF-κB抑制劑(PDTC及PS-341)均可抑制NF-κB的表達從而增加了由射線介導(dǎo)的細胞凋亡,提高HeLa細胞對放療的敏感性.同時,在前列腺癌中,也發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB的活性能增加放療敏感性.Kozakai[19]等人將新型的NF-κB抑制劑, DHMEQ應(yīng)用于經(jīng)放射線處理后的前列腺癌細胞,細胞周期分析顯示,細胞停滯于G2/M期,放療誘導(dǎo)的NF-κB受到了DHMEQ的抑制.體外研究結(jié)果顯示,在接受治療的64d后,腫瘤縮小程度與對照組相比,放療組是64.7%,DHMEQ組是77.1%,兩者聯(lián)合組是85.1%.說明DHMEQ能抑制放療誘導(dǎo)的NF-κB活性,同時減輕放療耐受反應(yīng).

放化療會引起DNA片段的損傷并通過激活I(lǐng)KK來增加NF-κB DNA結(jié)合活性,核蛋白ATM的DNA片段損傷后,通過NF-κB經(jīng)典途徑激活I(lǐng)KK使其與NF-κB分離,從而轉(zhuǎn)位至胞核.Barre[20]的研究認為DNA損傷以經(jīng)典/非經(jīng)典途徑來誘導(dǎo)NF-κB(p52)的產(chǎn)生.Bednarski[21]等人利用基因敲除和基因沉默的腫瘤模型證明IKK活性與NF-κB誘導(dǎo)的化療耐受密切相關(guān).在化療耐藥癌細胞株中發(fā)現(xiàn)NF-κB蛋白的高表達[22],對放療耐受的早期喉癌病人樣本也同樣發(fā)現(xiàn)NF-κB的高表達[23],因此,NF-κB抑制劑也許是放化療耐受病人的新曙光.

4.2 NF-κB抑制劑在宮頸癌的治療通過動物模型和人類疾病的大量研究,發(fā)現(xiàn)NF-κB在許多疾病發(fā)病機制中扮演關(guān)鍵角色,因而針對NF-κB的靶向治療可能對許多相關(guān)疾病奏效,并已得到證實.在宮頸癌治療方面,NF-κB抑制劑的應(yīng)用還需進行臨床實驗.最近,Wang[24]的研究發(fā)現(xiàn)Morusin (桑辛素)作為腫瘤抑制劑,其通過NF-κB信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用.經(jīng)桑辛素處理的人宮頸癌細胞,其增殖、轉(zhuǎn)移及腫瘤形成速度明顯減弱,DAPI染色的凋亡細胞增多,凋亡性DNA片段形成;免疫印跡的結(jié)果顯示NF-κB(p65)的表達以劑量依賴性方式下調(diào).證實了Morusin(桑辛素)能靶向人宮頸癌細胞,通過NF-κB信號通路抑制其生長和遷移.

孫建國[25]等人從蘑菇中提取到一種天然藥物成分Clitocine(克力托辛),并發(fā)現(xiàn)該化合物能有效抑制多種腫瘤細胞的增殖,其分子機理就是抑制了NF-κB信號通路.MTT法結(jié)果顯示該化合物對宮頸癌細胞HeLa、肝癌細胞HepG2、胃癌細胞SGC-7901等多種癌細胞都表現(xiàn)出較高的活性抑制.將Clitocine與阿霉素(Doxorubicin)聯(lián)合使用可有效增強化療耐藥細胞對阿霉素的敏感性,流式細胞術(shù)的數(shù)據(jù)顯示,Clitocine能夠增加阿霉素在細胞內(nèi)的積累,明顯提高低濃度下阿霉素對耐藥性腫瘤細胞的殺傷作用.電泳遷移率實驗(EMSA)發(fā)現(xiàn)Clitocine能夠有效抑制NF-κB的激活,并阻止活化的NF-κB向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)運.他們將耐藥性腫瘤細胞R-HepG2接種到裸鼠皮下,將剝離的腫瘤組織行免疫組織化學(xué)實驗,結(jié)果表明Clitocine能夠抑制體內(nèi)NF-κB的表達.同時,熒光定量PCR數(shù)據(jù)顯示Clitocine通過下調(diào)NF-κB來抑制P-糖蛋白的表達,繼而逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性.

綜上所述,NF-κB異?；罨笸ㄟ^不同的作用機制調(diào)控其下游基因,促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展.因此,抑制NF-κB的活性成為宮頸癌治療的分子基礎(chǔ),也為攻克宮頸癌放化療耐受提供了新的手段.然而,進一步將其應(yīng)用于臨床的治療,還需深入探討NF-κB作用于宮頸癌的準確時間點及部位,NF-κB抑制劑在治療的同時可能發(fā)生的毒副反應(yīng),患者對其的耐受力等問題.總之,我們推測NF-κB抑制劑的應(yīng)用將對腫瘤的擴散轉(zhuǎn)移提供新的預(yù)防治療手段,抑制NF-κB活性的治療也許能增加腫瘤對放化療的敏感性,也可作為當前治療的輔助手段.

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.讀者.作者.編者.

實驗與檢驗醫(yī)學(xué)計量使用與統(tǒng)計學(xué)要求

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2014-01-07)

甘自立:女,生于1987年10月,南昌大學(xué)碩士研究生,研究方向:腫瘤免疫學(xué),e-mail:295733625@qq.com.cn.

林紅:女,生于1961年10月,教授,主任醫(yī)師,研究方向:腫瘤免疫學(xué).