劉聰，戴薇，肖德俊，鄒翠翠綜述，肖九長審校

(贛州市人民醫(yī)院檢驗科，江西贛州341000)

·綜述·

巨細(xì)胞病毒感染診斷方法的研究進(jìn)展

劉聰，戴薇，肖德俊，鄒翠翠綜述，肖九長審校

(贛州市人民醫(yī)院檢驗科，江西贛州341000)

∶巨細(xì)胞病毒在人群中傳播廣泛，其在我國成人的感染率超過95%，且存在地域差異。多數(shù)感染者表現(xiàn)為亞臨床癥狀及潛伏感染。但在感染后較大程度上可侵襲多種器官導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，免疫功能減弱的情況下會對患者的身體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，孕婦和兒童感染巨細(xì)胞病毒后對身體損害較為嚴(yán)重，可導(dǎo)致胎兒畸形、兒童智力發(fā)育障礙等，因此巨細(xì)胞病毒早期診斷尤為重要，本文就巨細(xì)胞病毒感染診斷方法研究進(jìn)展綜述如下。

巨細(xì)胞病毒感染；診斷方法；研究進(jìn)展

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.019

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在我國感染非常普遍，是皰疹病毒科最大的病毒[1]，在免疫功能低下的人群中如孕婦、兒童可導(dǎo)致嚴(yán)重的危害，有可能會發(fā)展為HCMV綜合癥，出現(xiàn)小頭畸形、聽力和視力損害等后遺癥[2]。因此對HCMV感染的早期準(zhǔn)確診斷具有重要的臨床意義。

1 CMV的結(jié)構(gòu)及生物性狀

CMV屬于皰疹病毒的亞科，分子量約為150× 106，是線狀雙股DNA，內(nèi)核直徑230nm，外核為110nm的二十倍體，二者合稱為核衣殼。其被膜上蛋白約14種，其中膜蛋白pp65可作為CMV活動性感染的檢測指標(biāo)[3]。CMV存在于血液、唾液、眼淚、尿液、精液、糞便、子宮頸和陰道分泌物、乳汁等中。病毒可由乳汁、唾液及尿排出，可持續(xù)數(shù)周到幾年[4]。

2 巨細(xì)胞病毒感染情況及途徑

CMV根據(jù)感染發(fā)生時間的不同可分為先天性感染(宮內(nèi)感染)、獲得性感染(圍產(chǎn)期感染)及產(chǎn)后感染[5]。

2.1 先天性巨細(xì)胞病毒感染先天性巨細(xì)胞病毒感染即宮內(nèi)感染，經(jīng)母嬰傳播是胎兒CMV感染的主要途徑[6]，其具體途徑為：母親本身攜帶的巨細(xì)胞在其妊娠期期間，通過胎盤傳遞給胎兒，并存在較高的幾率導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)或死胎等，活嬰中約有5%會出現(xiàn)多系統(tǒng)、多器官受累，約5%會表現(xiàn)為非典型的臨床癥狀，90%為亞臨床癥狀。有文章報道，先天性CMV感染大約占新生兒0.15%～2%[7]。經(jīng)母嬰傳播導(dǎo)致先天性巨細(xì)胞病毒感染率國外報道可達(dá)23%[5]，其感染率比國內(nèi)報道的要低。

2.2 獲得性巨細(xì)胞病毒感染獲得性巨細(xì)胞病毒感染即圍產(chǎn)期巨細(xì)胞病毒感染，是指分娩時巨細(xì)胞病毒通過產(chǎn)道傳播給新生兒[8]。它與先天性巨細(xì)胞病毒感染不同的是感染CMV的母親所生的孩子出生14d內(nèi)無法診斷出CMV感染，要到新生兒出生3～12周內(nèi)才能證實CMV感染[9]。

2.3 產(chǎn)后感染產(chǎn)后感染即出生后獲得的感染，是指在母乳喂養(yǎng)過程中經(jīng)乳汁直接傳遞給嬰兒，也可由母嬰經(jīng)唾液等水平傳播引起[10]。

3 巨細(xì)胞病毒感染的臨床表現(xiàn)

成人感染CMV與自身免疫功能有密切的關(guān)系。CMV感染一般以潛伏感染的形式存在，當(dāng)患者發(fā)生腫瘤或器官移植尤其是腎移植后等自身免疫功能低下或缺失時潛在的病毒才會復(fù)活增值表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。潛在感染及顯性感染的患者均可成為傳染源[11]。調(diào)查研究表明，不同區(qū)域和不同經(jīng)濟(jì)情況感染率不同，其中亞洲和非洲感染率明顯比西方發(fā)達(dá)國家要高，且多發(fā)生在青少年階段。低收入人群感染率要高于高收入人群[12]。此外，CMV還可侵犯全身各器官，或可導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)、足兒小樣、聽力及智力障礙等。

4 巨細(xì)胞病毒感染診斷

4.1 血清學(xué)診斷當(dāng)CMV感染人體后，會出現(xiàn)一些特異性抗體，如IgM、IgG等，孕婦血清中檢測到IgM可證實感染CMV，要判斷胎兒感染的風(fēng)險就要進(jìn)一步證實孕婦是否發(fā)生原發(fā)感染。但是研究表明IgM的陽性率較低，要在感染2～4周之后才能檢測到，而新生兒和免疫力低下的人還有可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[13]。有研究表明IgM水平與CMV的復(fù)制程度無相關(guān)性[14]，而巨細(xì)胞病毒IgG在評估免疫功能低下人群巨細(xì)胞病毒活動性感染上無價值[15]。我國孕期女性CMV經(jīng)胎盤感染新生兒的概率可達(dá)35%，因此對孕婦進(jìn)行CMV檢測很重要。目前臨床上普遍采用ELISA法來檢測孕婦血清中特性抗體IgM是否為陽性來初步判斷CMV感染。ELISA法步驟簡單，時間短，便于臨床應(yīng)用，但是存在陽性率低，且易出現(xiàn)假陰性，而且出現(xiàn)時間較晚等不足[16]。

4.2 病毒培養(yǎng)病毒分離是目前實驗室診斷CMV的金標(biāo)準(zhǔn)[17]。該法就是將檢測標(biāo)本接種后檢測是否存在包涵體。這種方法容易污染，步驟復(fù)雜，不利于臨床快速診斷，還存在的最大問題是CMV只在人纖維母細(xì)胞中增殖，因此檢測周期較長，只適合用于科研途徑[18]。

4.3 巨細(xì)胞病毒抗原檢測目前國外文獻(xiàn)報道的CMV抗原檢測通常采用ABC法或免疫熒光檢測法[19]。CMV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制6～24h后會產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白，其中的被膜蛋白大部分是pp65。在20世紀(jì)80年代Vinder[20]就建立了免疫熒光定量等方法來檢測pp65。當(dāng)CMV處于活動期時，外周血中會存在高水平的pp65抗原，其可作為CMV感染的活動性檢測。近年來檢測pp65抗原的方法得到了很大發(fā)展，現(xiàn)在有些實驗室利用流式細(xì)胞術(shù)來檢測pp65抗原，只需約2h，其操作步驟簡單，靈敏度高，特異性好，步驟簡單，靈敏度和特異性都很好，值得臨床上推廣。Piiparinen等[21]認(rèn)為血液中的pp65抗原的表達(dá)水平可預(yù)測發(fā)生HCMV感染的風(fēng)險度。有資料表明pp65抗原檢測可用于診斷HCMV活動性感染,還可作為指導(dǎo)臨床用藥及監(jiān)測藥物療效的一個監(jiān)測指標(biāo)[22]。

4.4 病毒DNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測病毒DNA與免疫酶鏈法、病毒培養(yǎng)等方法相比，具有步驟簡便，靈敏度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點，還能做CMV定量分析。但是普通PCR也存在不足，容易造成污染和假陽性的缺點?，F(xiàn)在的新方法實時熒光定量PCR就是在原來的反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，可實時檢測PCR進(jìn)程，進(jìn)而實現(xiàn)定量分析的目的。此方法具有普通PCR的優(yōu)點外，還能進(jìn)行CMV感染的動態(tài)監(jiān)測，重復(fù)性也好,還能進(jìn)行早期檢測CMV[22]。

綜上所述，血清學(xué)診斷由于其陽性率較低，容易受到病人體質(zhì)等因素的影響，很容易造成假陰性結(jié)果，已經(jīng)不能滿足臨床檢測對于高靈敏度和特異度的要求。病毒培養(yǎng)由于其操作的復(fù)雜性以及對培養(yǎng)環(huán)境的嚴(yán)格要求，也很難滿足臨床對于快速診斷的需要，實時熒光定量PCR雖具有其獨特的優(yōu)點，但是同流式細(xì)胞計數(shù)比較而言，卻也有其不足之處,比如實時熒光定量PCR引物的設(shè)計很關(guān)鍵，決定著實驗成功與否，還有RNA模板提取效率、反轉(zhuǎn)錄效率、標(biāo)準(zhǔn)品的選擇與制備、熒光閾值的設(shè)置等復(fù)雜實驗操作[23]。流式細(xì)胞術(shù)作為一個新興的技術(shù)已經(jīng)從科研領(lǐng)域逐步過渡到了為臨床服務(wù)，因其具有高靈敏性和快速性的優(yōu)點，逐步被大家所接納和認(rèn)可。

[1]萬華,都莉.免疫低下狀態(tài)群體感染人巨細(xì)胞病毒的研究進(jìn)展[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2012,30(6)∶573-575.

[2]姚曄,萬瓊,王衛(wèi)國,等.應(yīng)用FQ-PCR和ELISA方法檢測人巨細(xì)胞病毒感染的臨床價值[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2012,30(2)∶172-173.

[3]董永綏.嬰兒巨細(xì)胞病毒性肝炎[J].臨床兒科雜志,2006,24(1)∶74.

[4]Manuel O,Wójtowicz A,Bibert S,et al.Influence of IFNL3/4 polymorphisms on the incidence of cytomegalovirus infection after solid-organ transplantation[J].J Infect Dis,2014,Oct9.pii∶jiu557.

[5]Einsele H,Mielke S,Grigoleit GU.Diagnosis and treatment of cytomegalovirus 2013[J].Curr Opin Hematol.2014,21(6)∶470-475.

[6]李鳳中,黃永建,陳波.新生兒高膽紅素血癥巨細(xì)胞病毒DNA檢測的意義[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2010,28(4)∶390.

[7]Chen PY,Xie ZD,Wang T.Clinical investigation on Ganciclovirapplied to treat nconatal CMV infection[J].J Chin Phycisian,2003,5 (4)∶502-504.

[8]裴蘊(yùn)鋒.新生兒人巨細(xì)胞病毒感染的診斷與治療進(jìn)展[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2013,10(8)：980-981.

[9]Azam A,Vial Y,Fawer C,et al.Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection[J].Obstet Gynaccol,2001,97(3)∶443-448.

[10]段泓宇,喻韜,萬朝敏.巨細(xì)胞病毒感染診斷及治療進(jìn)展[J].中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜雜志，2010,6(1)∶68-69.

[11]Caruso C,Buffa S,Candore G et al.Mechanisms of immunosenescence[J].Immun Ageing,2009,6∶10.

[12]Ryan KJ,Ray CG.Sherris Medical Microbiology 4th[M].New York∶McGraw Hill,2004∶556;566-569.

[13]呂賽平,劉琴,鄒學(xué)森.自建檢測系統(tǒng)測定血清總蛋白精密度性能的評價[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2013,31(4)∶314-316.

[14]Bendikse S,vanGhelue M,Rekvig OP,et al.A longitudinal study of human cytomegalovirus serology and viruria fails to detect avtive viral infection in 20 systemic lupus erythematosus patients[J].Lupus,2000,9(2)∶120.

[15]吳國華,羅燦嶠,賴英榮,等.腎移植及骨髓移植受者術(shù)后巨細(xì)胞病毒早早期抗原的檢測[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2010,14(44)∶8204-8205.

[16]熊陽瓊,楊雨文,黃丁能.ELISA一步法和二步法檢測HBsAg結(jié)果的對比分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2013,31(1)∶96-97.

[17]戴春來,尹艷娥,李恒,等.各種檢測方法在巨細(xì)胞病毒感染診斷中的意義[J].中國實驗診斷學(xué),2010,12(14)∶2058-2059.

[18]陳平洋.新生兒人巨細(xì)胞病毒感染的診斷與治療進(jìn)展[J].實用兒童臨床雜志,2008,23(2)∶85.

[19]Egan JJ,Barber L,Lomax J,et al.Detection of human cytomegalovirus antigenaemia∶a rapiddiagnostic technique for predicting cytomegalovirus infection[J].Thorax,1995(50)∶9-13.

[20]vin der Bij W,Torensma R,van Son WJ,et al.Rapid immunodiganosis of active cytomegalovirus infection by monoclonal antibody staining of blood leukocytes[J].J Med Virol,1988,25(2)∶179-188.

[21]Piiparinen H,Hockerstedt K,Lappalainen M,et al.Monitoring of viralloadbyquantitativeplasmaPCRduringactivecytomegalovirus infection of individual liver transplant patients[J].J Clin Microbiol,2002,40(8)∶2945-2946.

[22]Solana R,Tarazona R,Aiello AE,et al.CMV and Immunosenescence∶from basics to clinics[J].Immun Ageing,2012,9(1)∶23.

[23]許小紅,劉在新,包慧芳,等.實時熒光定量RT-PCR技術(shù)及其存在問題和優(yōu)化方案[J].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2006年學(xué)術(shù)年會論文集(上冊),2006∶489-490.

R373

A

1674-1129(2014)06-0703-02

2014-05-04；

2014-10-16)

劉聰，女，1986年12月生，碩士，檢驗師，研究方向為臨床免疫學(xué)。

肖九長，男，1969年9月生，本科，副主任技師，研究方向為臨床免疫學(xué)。