王菲，楊長(zhǎng)青

·專家論壇·

2014年美國(guó)藥物性肝損傷會(huì)議內(nèi)容簡(jiǎn)介*

王菲，楊長(zhǎng)青

藥物性肝損傷；生物標(biāo)志物；診斷

藥物性肝損傷（Drug induced liver injury，DILI）是目前國(guó)際肝病研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。美國(guó)定期舉辦的全球性DILI研討會(huì)至今已經(jīng)有15年的歷史。由美國(guó)食品藥品管理局（FDA）/藥物評(píng)價(jià)與研究中心（CDER）、關(guān)鍵路徑研究所（C-Path）以及醫(yī)藥研究與制造商協(xié)會(huì)（PhRMA）共同主辦的第14屆DILI研討會(huì)于2014年3月1 9日～20日在美國(guó)華盛頓馬里蘭大學(xué)召開，會(huì)議同時(shí)得到美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）藥物肝損傷研究網(wǎng)絡(luò)（DILIN）以及美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)（AASLD）專家的支持，專家們就DILI的學(xué)術(shù)問題展開了充分討論，積極并深入地推動(dòng)了該領(lǐng)域的學(xué)術(shù)發(fā)展?，F(xiàn)將本次會(huì)議中的幾個(gè)亮點(diǎn)和熱點(diǎn)內(nèi)容向大家介紹如下。

1 探索DILI生物標(biāo)志物

來(lái)自美國(guó)卡羅來(lái)納醫(yī)學(xué)中心教育和研究高級(jí)顧問、醫(yī)學(xué)博士赫伯特邦科夫斯基（Herbert L. Bonkovsky）教授首先介紹了他們?cè)贒ILI診斷中探索生物標(biāo)志物方面的研究成果。

由于急性DILI在病因、病程及預(yù)后判斷上有時(shí)與急性肝炎很難鑒別，因此他們通過對(duì)78例DILI確診者在發(fā)病時(shí)和6個(gè)月時(shí)患者血清進(jìn)行27種相關(guān)免疫因子測(cè)定，同時(shí)與40名正常人進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有19種免疫物質(zhì)與對(duì)照組存在顯著性差異。無(wú)論是何種免疫反應(yīng)模式，涉及固有免疫和適應(yīng)性細(xì)胞免疫因子（主要是Th17）的差異最為顯著[1]。該結(jié)論提示，急性DILI與增強(qiáng)的不同免疫反應(yīng)有關(guān)，固有免疫相關(guān)細(xì)胞因子的高水平表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)，而適應(yīng)性免疫相關(guān)細(xì)胞因子的高水平表達(dá)則提示遠(yuǎn)期預(yù)后良好。

他們同時(shí)進(jìn)行的另一項(xiàng)比較研究發(fā)現(xiàn)，DILI患者肝組織存在大量的細(xì)胞毒性（CD8+）T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞/枯否細(xì)胞（KC），CD4+輔助T細(xì)胞或B細(xì)胞數(shù)量很少，而自然殺傷（NK）細(xì)胞幾乎不存在，提示在組織學(xué)上DILI顯著有別于急性病毒性肝炎和特異性自身免疫性肝炎[2]。上述研究表明，急性DILI與急性病毒性肝炎、特異性自身免疫性肝炎肝組織中白細(xì)胞浸潤(rùn)的模式存在差異，這將有助于急性DILI與急性病毒性肝炎或自身免疫性肝炎相鑒別。

而英國(guó)利物浦大學(xué)藥理學(xué)Dan Antoine教授和美國(guó)FDA藥物評(píng)價(jià)與研究中心副主任Mark Avigan博士認(rèn)為，目前，無(wú)論是醫(yī)生還是研究人員，運(yùn)用血清生化標(biāo)志診斷DILI的發(fā)生都是可行的。DILI診斷的常用生化指標(biāo)主要是丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）和總膽紅素（TBil）。但這些指標(biāo)都是反映已經(jīng)發(fā)生的肝損傷，而且在DILI的早期階段也只有40%的患者出現(xiàn)異常[3]。

近年來(lái)，對(duì)微小RNA研究的熱潮興起，也擴(kuò)大了對(duì)DILI研究的新方向。經(jīng)過一些前期研究已發(fā)現(xiàn)部分微小RNA可以作為DILI的生物標(biāo)志，如miR-122、miR-192、miR-193、miR-802和miR-29c等[4，5]。其中，miR-122在肝臟損傷中的特異性較強(qiáng)，在對(duì)乙酰氨基酚（APAP）所致的DILI中，其特異性和敏感性均高于ALT[6]。

盡管發(fā)現(xiàn)了多個(gè)DILI的生物標(biāo)志，但基本處于實(shí)驗(yàn)研究階段，距進(jìn)入臨床運(yùn)用尚需時(shí)日。同時(shí)，由于藥品的多樣性和人體的差異性、復(fù)雜性，有關(guān)DILI生物標(biāo)志物的研究仍然任重道遠(yuǎn)。目前，歐洲已有開展生物標(biāo)志物的相應(yīng)研究（IMISAFE-T）進(jìn)展，IMISAFE-T項(xiàng)目組歷時(shí)5年進(jìn)行的2項(xiàng)核心研究，一項(xiàng)對(duì)500例疑似DILI患者進(jìn)行研究，以期尋找判斷預(yù)后的新的生物標(biāo)志物；而另一項(xiàng)則是對(duì)160例因使用抗結(jié)核藥物而發(fā)生DILI的患者進(jìn)行研究，評(píng)估新的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)DILI的價(jià)值。該項(xiàng)目的研究目的是希望篩選出適合的生物標(biāo)志物，用于準(zhǔn)確預(yù)測(cè)或判斷藥物引起的針對(duì)不同靶器官的損傷。為解決DILI的診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物等問題，預(yù)測(cè)安全性測(cè)試聯(lián)盟（PSTC）肝毒性工作組（HWG）致力于改善藥品開發(fā)工具、檢測(cè)和監(jiān)測(cè)藥品毒性，改善藥物開發(fā)中新的生物標(biāo)志物的性能。

2 干擾素調(diào)節(jié)因子-3（Interferon regulatory factor-3，IRF-3）途徑與肝細(xì)胞死亡在DILI和酒精性肝病中的診斷意義

麻省州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授、肝病中心主任Gyongyi Szabo博士認(rèn)為，由非折疊蛋白聚集所導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress）是肝臟疾病發(fā)生的重要因素，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促成肝細(xì)胞死亡的機(jī)制，目前仍未闡明。干擾素基因刺激因子（Stimulator of interferon genes，STING）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白家族的成員，通過激活I(lǐng)RF-3和I型干擾素而發(fā)揮抗病毒的免疫活性作用。他們運(yùn)用酒精喂食或毒胡蘿卜素誘導(dǎo)正常小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和肝細(xì)胞凋亡，隨之產(chǎn)生了I型干擾素應(yīng)答，但在IRF-3基因剔除小鼠，同樣的措施則不能產(chǎn)生以上效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IRF-3的磷酸化以及所誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡，與炎癥和KCs的形成無(wú)關(guān)，甚至早于炎癥的產(chǎn)生，但需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白STING的參與，之后才發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。激活的IRF-3與凋亡前蛋白caspase-8和Bax密切相關(guān)，隨之而啟動(dòng)線粒體凋亡的路徑。而在STING剔除的小鼠在酒精刺激下則無(wú)IRF-3的激活、肝細(xì)胞的死亡和肝纖維化的發(fā)生。這一新發(fā)現(xiàn)提示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)了內(nèi)部免疫途徑所促成的肝細(xì)胞損失，刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白STING可以磷酸化IRF-3而啟動(dòng)肝細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，封閉和阻斷STING和IRF-3的活化可能成為治療酒精和DILI的新思路[7]。

3 遺傳因素在DILI發(fā)生中的作用

英國(guó)紐卡斯堡大學(xué)遺傳藥理學(xué)的奠基人、藥學(xué)教授Ann Daly博士認(rèn)為，特殊的人類白細(xì)胞抗原（HLA）上的等位基因是不同人群對(duì)藥物產(chǎn)生不同反應(yīng)的關(guān)鍵因素。比如在氟氯西林引起DILI的人群中，HLA-B*57:01的基因型達(dá)80%以上[8]，而在阿莫西林克拉維酸引起的DILI中，HLA-DRB1*15:01和HLA-A*02:01的基因型也可達(dá)30%[9]。然而，盡管這些DILI與HLA基因相關(guān)聯(lián)的研究已經(jīng)很清楚、可重復(fù)，但目前仍不能僅根據(jù)單一的基因型分析去預(yù)測(cè)DILI的發(fā)生，比如至今仍不能根據(jù)HLA基因型去預(yù)測(cè)異煙肼、非甾體類抗炎藥或他汀類藥物誘發(fā)DILI的風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，已有研究表明，通過外顯子測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)非HLA相關(guān)的PTPN22基因和STAT4基因與多種藥物誘發(fā)的DILI相關(guān)[10]。所以，聯(lián)合基因組分析可能更有助于尋找DILI發(fā)生的遺傳危險(xiǎn)因素，但是非基因遺傳的因素如年齡等也需多加關(guān)注。

4 免疫因素在DILI發(fā)生中的作用

過去，曾把DILI的發(fā)生機(jī)制分為免疫特異性和代謝特異性。近年來(lái)，關(guān)于免疫相關(guān)機(jī)制的證據(jù)則越來(lái)越多，如HLA關(guān)聯(lián)免疫、重復(fù)用藥的快速發(fā)作、抗藥物抗體、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性等。加拿大藥物不良反應(yīng)研究中心主席、多倫多大學(xué)藥理學(xué)教授Jack Uetrecht博士在本次大會(huì)上提出，特異性的藥物反應(yīng)用特異性的免疫機(jī)制去解釋是容易被接受的。相反，由藥物代謝差異所致DILI發(fā)生的事例則很難找出。代謝特異性DILI的主要病因常常舉證異煙肼，主要是因?yàn)楫悷熾滤翫ILI不通過免疫記憶介導(dǎo)，重復(fù)使用并不能引起快速發(fā)作。其實(shí)，已有證據(jù)表明即使是免疫特異性介導(dǎo)的DILI也可以不通過免疫記憶，而近來(lái)有研究表明由異煙肼引發(fā)的重癥DILI還是通過免疫記憶介導(dǎo)的。Uetrecht教授課題組的研究發(fā)現(xiàn)，異煙肼在小鼠、人和大鼠中的代謝是顯著不同的。在小鼠和人群中異煙肼可以直接通過氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷肝臟蛋白的共價(jià)鍵。在異煙肼導(dǎo)致肝衰竭患者中，發(fā)現(xiàn)有抗異煙肼調(diào)節(jié)蛋白抗體或抗P450抗體的產(chǎn)生。在異煙肼導(dǎo)致輕微DILI的患者，有Th7細(xì)胞和產(chǎn)生IL-10的T細(xì)胞增加，從而推論異煙肼導(dǎo)致輕微DILI也是通過免疫介導(dǎo)的，只是因?yàn)樵黾拥腎L-10而導(dǎo)致了部分免疫耐受的形成，從而不發(fā)生快速應(yīng)激。盡管HLA特異型基因也是許多DILI發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，但是用相關(guān)藥物卻常常無(wú)法誘導(dǎo)出HLA特異型基因的DILI。機(jī)體免疫系統(tǒng)的反應(yīng)不僅通過HLA相關(guān)基因，而且也通過T細(xì)胞受體編碼基因的隨機(jī)組合，而這些基因表達(dá)常常會(huì)受到患者所暴露的免疫原的調(diào)節(jié)。組織學(xué)研究提示，CD8+T細(xì)胞是DILI的主要免疫細(xì)胞，以此為據(jù)，或許以后可以通過適度的免疫抑制去預(yù)防DILI相關(guān)的肝功能衰竭[11～13]。

5 線粒體極化與DILI發(fā)生的關(guān)系

線粒體損傷標(biāo)志物包括谷氨酸脫氫酶（GLDH）、線粒體DNA（mtDNA）及其降解片段，也是DILI發(fā)生的標(biāo)志物。細(xì)胞凋亡標(biāo)志角蛋白-18（Keratin-18）和細(xì)胞壞死標(biāo)志也可作為DILI不同階段的生物標(biāo)志。高遷移率族蛋白1（HMGB1）是一種重要的晚期炎癥介質(zhì)，可作為DILI的免疫損傷指標(biāo)，對(duì)判斷DILI的嚴(yán)重程度和預(yù)后有重要價(jià)值[14]。

美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)（AASLD）主席、Hepatology主編、阿爾伯特愛因斯坦醫(yī)學(xué)院榮譽(yù)教授、NIH高級(jí)科學(xué)家Irwin Arias教授在近年來(lái)關(guān)注于線粒體的運(yùn)動(dòng)和極化在肝細(xì)胞損傷中的意義。通常在感染、DILI、膽汁淤積和休克等情況下，可發(fā)生肝細(xì)胞的去極化，但因膽小管在HE染色時(shí)常不被顯現(xiàn)，因而該去極化現(xiàn)象很少被關(guān)注。在肝細(xì)胞去極化時(shí)，可引起膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體微管蛋白ABCB11的內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)，從而導(dǎo)致膽汁酸介導(dǎo)的細(xì)胞器損傷，特別是線粒體的損傷。通過無(wú)糖饑餓培養(yǎng)肝細(xì)胞后再恢復(fù)營(yíng)養(yǎng)的方法刺激肝細(xì)胞應(yīng)激，可在體外產(chǎn)生去極化反應(yīng)，隨之發(fā)生ATP減少、脂滴形成、線粒體裂變和自噬（Autophagy）。在同時(shí)下調(diào)線粒體裂變蛋白和上調(diào)線粒體融合蛋白后，極化的線粒體很快復(fù)極。在這一過程中，通過快速降低脂滴、減少脂肪酸前體的beta氧化，增加了ATP的合成。而自噬的上調(diào)又導(dǎo)致了細(xì)胞器循環(huán)再利用的增加，加強(qiáng)了細(xì)胞的復(fù)極。僅在ATP水平上升5天之后，AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）就隨之被激活了。這一結(jié)果提示，通過肝細(xì)胞內(nèi)的線粒體融合、脂滴消耗、自噬發(fā)生和活化AMPK，ATP和極化前體的合成很快增加，隨之再發(fā)生ATP水平的下降[15]。這一出乎意外的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，說明肝臟在感染、藥物損傷和休克等情況下，通過線粒體的裂解、去極化可導(dǎo)致肝功能衰竭的發(fā)生，而這一方法也對(duì)深化研究DILI的發(fā)生機(jī)制提供新的工具。

6 未來(lái)與挑戰(zhàn)

本屆研討會(huì)主席Senior博士回顧了自1999年以來(lái)，全世界在面對(duì)DILI所作出的努力和研究成果，同時(shí)提出本屆會(huì)議的主題是“在患者中預(yù)測(cè)嚴(yán)重DILI：誰(shuí)會(huì)發(fā)生？誰(shuí)不會(huì)發(fā)生？為什么？”希望通過會(huì)議能夠探尋對(duì)DILI新的理解，識(shí)別出少數(shù)特殊的可疑患者，在其病情演變?yōu)椴豢赡嬷安扇》e極干預(yù)措施。在會(huì)議上，Senior博士還提出未來(lái)發(fā)展的重點(diǎn)是發(fā)現(xiàn)新的以及有效的DILI生物標(biāo)志物。

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（收稿：2014-08-29）

（校對(duì)：陳從新）

Focus on drug induced liver injury：Brief introduction of the 14th AASLD meeting

Wang Fei，Yang Changqing. Department of Gastroenterology，Tongji Hospital，Tongji University，Shanghai 200065

Drug induced liver injury；Biological markers；Diagnosis

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.06.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（No.81370559）；上海市科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃（No.12431901002）；上海市科研計(jì)劃項(xiàng)目（14411971500）

200065上海市同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院消化科

王菲，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師。E-mail:1132469@# edu.cn

楊長(zhǎng)青，E-mail:cqyang@#edu.cn