黃 聰，李再園，王福蓮*，張桂芬，李傳仁，李詠軍

(1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

昆蟲屬于變溫動(dòng)物，溫度是影響其種群動(dòng)態(tài)的一種最基本的因素，在某些地區(qū)，寒冷冬季的持續(xù)低溫對(duì)昆蟲種群的延續(xù)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，因此昆蟲往往通過(guò)調(diào)節(jié)自身的過(guò)冷卻 (supercooling)狀態(tài)以增強(qiáng)其抗寒性，使其種群得以繁衍和延續(xù)(Maureen and Richard，1990;崔雙雙和賀一原，2011)。昆蟲過(guò)冷卻是指溫度低于昆蟲體液結(jié)冰點(diǎn)時(shí)，其體液仍能保持液體狀態(tài)的現(xiàn)象 (李冰祥等，1998);耐寒性是指昆蟲維持蟲體的過(guò)冷卻狀態(tài)，使之免受凍害的能力 (Lee，1989)。在昆蟲耐寒性研究中，過(guò)冷卻點(diǎn) (supercooling point，SCP)常作為一項(xiàng)重要指標(biāo)來(lái)界定昆蟲的耐寒性強(qiáng)弱 (侯柏華和張潤(rùn)杰，2007)。通過(guò)過(guò)冷卻點(diǎn)的測(cè)定，有助于了解某種昆蟲的抗寒能力，更好地掌握其生殖、擴(kuò)散、發(fā)生分布規(guī)律以及下一季節(jié)的種群發(fā)生狀態(tài)等 (McDonald et al.，1999;Sage et al.，1999)。McDonald等 (2000)的研究指出，明確昆蟲的耐寒性及其越冬生物學(xué)特性，對(duì)于掌握其在某一地區(qū)的分布現(xiàn)狀、種群擴(kuò)張趨勢(shì)，以及實(shí)時(shí)預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和根治等均具有重要作用。

柑桔大實(shí)蠅為一化性昆蟲，成蟲產(chǎn)卵于柑桔幼果內(nèi)，卵孵化為幼蟲后，取食桔瓣，于柑桔內(nèi)完成發(fā)育;10月中下旬幼蟲脫果入土化蛹，11月上中旬大部分幼蟲已入土化蛹，進(jìn)入越冬狀態(tài);翌年3月下旬至4月上旬滯育蛹解除滯育開始發(fā)育，4月下旬至5月上旬成蟲開始羽化 (吳志清，1958;羅祿怡和陳長(zhǎng)風(fēng)，1987;汪興鑒和羅祿怡，1995;王小蕾和張潤(rùn)杰，2009)。因此，幼蟲和蛹對(duì)低溫的耐受能力以及當(dāng)?shù)囟镜臏囟葼顩r共同決定了柑桔大實(shí)蠅的越冬蟲源基數(shù)，進(jìn)而影響來(lái)年柑桔大實(shí)蠅的發(fā)生動(dòng)態(tài)和種群發(fā)生數(shù)量。本研究擬通過(guò)測(cè)定柑桔大實(shí)蠅老熟幼蟲和滯育蛹以及已解除滯育進(jìn)入發(fā)育狀態(tài)的蛹的過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)，以期揭示柑桔大實(shí)蠅的耐寒性及其對(duì)低溫的適應(yīng)能力，為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其在我國(guó)的適生區(qū)、擴(kuò)散區(qū)域及蟲源地越冬蟲口基數(shù)，為有效預(yù)測(cè)和制定柑桔大實(shí)蠅綜合防控策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

柑桔大實(shí)蠅的老熟幼蟲于10月下旬采自湖北省松滋市斯家場(chǎng)鎮(zhèn)旗林村。老熟幼蟲化蛹后已進(jìn)入滯育狀態(tài)的5日齡蛹作為滯育蛹 (范京安等，1994);翌年4月上旬當(dāng)越冬蛹發(fā)育為一級(jí)時(shí)，作為已解除滯育進(jìn)入發(fā)育狀態(tài)的蛹。

1.2 過(guò)冷卻點(diǎn)的測(cè)定

過(guò)冷卻點(diǎn)的測(cè)定參考秦玉川和楊建才 (2000)以及呂龍石等 (2010)的方法，測(cè)定儀器為數(shù)字萬(wàn)用電表 (DT 9205A，廣州恒惟電子科技有限公司)以及熱敏電阻 (NTC－MFH103，10KΩ，精度1%，25℃ B值3950;杭州電子市場(chǎng)恒堅(jiān)電子商行)。測(cè)定前用潔凈濾紙吸干老熟幼蟲或蛹體表面的水分，用自制的昆蟲夾 (由晾衣竹片夾和溫敏電阻組成，竹片夾由兩瓣竹片和一根彈簧組成，每瓣竹片長(zhǎng)6.2 cm，寬1.1 cm，厚0.6 cm，竹片內(nèi)側(cè)中間位置均勻分布有3個(gè)直徑為0.4 cm的凹槽，兩端凹槽距竹片端部均為2 cm，兩片竹片并攏時(shí)上下凹槽組成3個(gè)直徑為0.4 cm、高1.1 cm的圓柱型空間，其中彈簧固定在竹片夾一端的凹槽內(nèi)，溫敏電阻固定于另一端的凹槽處)迅速夾住供試?yán)ハx (使蟲體腹面緊貼熱敏電阻)，用脫脂棉包好昆蟲夾放入緩溫管 (50 mL指形管，長(zhǎng)11 cm，直徑3 cm)內(nèi)，于25℃可控低溫保存箱內(nèi)(DW－25W198，青島海爾特種電器有限公司)進(jìn)行電阻值變化的觀測(cè)。NTC－MFH103型玻璃熱敏電阻為負(fù)溫度系數(shù)熱敏電阻，亦即，隨蟲體體溫的下降，熱敏電阻值上升。當(dāng)電阻值逐漸上升到某一數(shù)值R1i時(shí)，體液開始形成冰晶而放熱使電阻值突然下降，此時(shí)R1i所對(duì)應(yīng)的溫度值即為過(guò)冷卻點(diǎn);當(dāng)下降到最低點(diǎn)R2i時(shí)，體液開始結(jié)冰，不再放熱，電阻值又會(huì)逐漸上升，此時(shí)R2i所對(duì)應(yīng)的溫度值即為結(jié)冰點(diǎn)，觀察結(jié)束 (秦玉川和楊建才，2000;呂龍石等，2010)。每個(gè)蟲態(tài)過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)測(cè)定30－35頭。

1.3 數(shù)據(jù)分析

NTC－MFH103型玻璃熱敏電阻的溫度系數(shù)B值的計(jì)算公式為:B=t1t2ln(rt1/rt2)/(t2－t1)，其中 t1、t2為生產(chǎn)廠家提供的熱敏電阻 Ri(kΩ)在rt1和rt2范圍時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度值，為絕對(duì)溫標(biāo)ti+273.15;過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)溫度Ti(℃)的計(jì)算公式為:Ti=t2B/［B+t2ln(Ri/r2)］ －273.15，Ri為過(guò)冷卻點(diǎn)或結(jié)冰點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的電阻值(呂龍石等，2010)。

采用單一樣本Kolmogorov－Smirnov法檢驗(yàn)分析不同發(fā)育狀態(tài)過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)的頻次分布特征，并以過(guò)冷卻點(diǎn)或結(jié)冰點(diǎn)值為橫坐標(biāo)作相對(duì)頻率分布圖，以單一變量最小顯著差法進(jìn)行方差分析 (SPSS)，比較柑桔大實(shí)蠅不同發(fā)育狀態(tài)的過(guò)冷卻點(diǎn)、體液結(jié)冰點(diǎn)及體液結(jié)冰點(diǎn)與過(guò)冷卻點(diǎn)之間差值的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑桔大實(shí)蠅不同發(fā)育狀態(tài)的過(guò)冷卻點(diǎn)、結(jié)冰點(diǎn)及其差值

柑桔大實(shí)蠅的發(fā)育狀態(tài)不同，其過(guò)冷卻點(diǎn)各異，而且三種發(fā)育狀態(tài)間的過(guò)冷卻點(diǎn)差異顯著(表1)。按過(guò)冷卻點(diǎn)由高到低依次為老熟幼蟲、滯育蛹和滯育解除蛹，分別為 －7.09℃、－8.93℃和－11.15℃;進(jìn)而其耐寒性的高低依次為滯育解除蛹＞滯育蛹＞老熟幼蟲。已解除滯育進(jìn)入發(fā)育狀態(tài)的蛹的過(guò)冷卻點(diǎn)變異范圍最大，為－15.36～－7.45℃;滯育蛹過(guò)冷卻點(diǎn)的變異范圍最小，為－11.09～－8.03℃。不同蟲態(tài)體液結(jié)冰點(diǎn)之間也存在顯著差異 (表1)，滯育解除蛹的結(jié)冰點(diǎn)最低為－9.76℃，其次為滯育蛹為 －7.63℃，而老熟幼蟲的結(jié)冰點(diǎn)最高為－3.43℃。其中，已解除滯育進(jìn)入發(fā)育狀態(tài)的蛹的過(guò)冷卻點(diǎn)的變異范圍最大，最低值為－13.49℃，最高值為－6.64℃;滯育蛹過(guò)冷卻點(diǎn)的變異范圍最窄，最低值為－9.03℃，最高值為－6.64℃。老熟幼蟲結(jié)冰點(diǎn)與過(guò)冷卻點(diǎn)之間的差值最大為3.24℃，顯著高于滯育蛹(1.30℃)和滯育解除蛹 (1.39℃)。而且，老熟幼蟲結(jié)冰點(diǎn)與過(guò)冷卻點(diǎn)之間差值的變異范圍最大，最低值為1.39℃，最高值為6.15℃;滯育解除蛹的變異范圍最窄，最低值為0.61℃，最高值為2.45℃ (表1)。

表1 柑桔大實(shí)蠅不同發(fā)育狀態(tài)的過(guò)冷卻點(diǎn)、結(jié)冰點(diǎn)及其差值 (℃ ，Mean±SE)Table 1 The supercooling points(SCP)，freezing points(FP)and their differences among different developing status of Bactrocera minax

2.2 柑桔大實(shí)蠅不同發(fā)育狀態(tài)過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)的相對(duì)頻率分布

圖1 柑桔大實(shí)蠅不同發(fā)育狀態(tài)過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)的分布頻率Fig.1 Distribution frequency of supercooling point and freezing point at different developing status of Bactrocera minax

測(cè)定結(jié)果表明，三種發(fā)育狀態(tài)的柑桔大實(shí)蠅其過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)均只有一個(gè)高峰，而且經(jīng)檢驗(yàn)其頻次分布特征均符合正態(tài)分布。其中，老熟幼蟲的過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)較高，分別集中在－3.5～－9.5℃以及－1.5～－5.5℃;滯育蛹次之，分別集中在－7.5～－11.5和－5.5～－9.5℃;而滯育解除蛹的過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)最低，分別集中在－8.5～ －14.5℃和－6.5～ －12.5℃ (圖1A，B)。進(jìn)而表明，經(jīng)過(guò)冬季低溫馴化已進(jìn)入發(fā)育狀態(tài)的蛹的抗寒性最強(qiáng)，其次為剛剛進(jìn)入滯育狀態(tài)的蛹，而老熟幼蟲的抗寒性最弱。

3 結(jié)論與討論

昆蟲的越冬策略主要有兩種類型，一是不耐結(jié)冰型 (freezing intolerant)，又稱避凍策略，這類昆蟲對(duì)體液中的冰晶所形成的損傷特別敏感，但它能盡量降低自身的過(guò)冷卻點(diǎn)，從而避免體液結(jié)冰以增強(qiáng)耐寒力，絕大多數(shù)昆蟲屬于這一類型;二是耐受結(jié)冰型 (freezing－tolerant)，又稱耐凍策略，這類昆蟲能夠主動(dòng)地形成冰核，通過(guò)提高過(guò)冷卻點(diǎn)以誘導(dǎo)細(xì)胞外液在較高的亞致死溫度下結(jié)冰，阻止細(xì)胞內(nèi)液的進(jìn)一步結(jié)冰，使胞內(nèi)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)免受傷害，從而避免造成更大的損傷 (Bale，2002;Jason and Richard，2002;Renault et al.，2002;景曉紅和康樂(lè)，2002;Brent et al.，2003)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柑桔大實(shí)蠅的越冬策略屬于避凍策略，老熟幼蟲過(guò)冷卻點(diǎn)為－7.09℃，化蛹后通過(guò)降低自身過(guò)冷卻點(diǎn)至－8.93℃進(jìn)入滯育狀態(tài)，從而增強(qiáng)耐寒性;翌年4月份，在外界環(huán)境因素的作用下，柑桔大實(shí)蠅滯育蛹解除滯育后，其過(guò)冷卻點(diǎn)再次降低至－11.15℃，說(shuō)明越冬后進(jìn)入發(fā)育狀態(tài)的蛹抗寒能力較滯育蛹更強(qiáng)。黃大樹等(2007)研究發(fā)現(xiàn)，柑桔大實(shí)蠅越冬后蛹的抗逆性比越冬前蛹的抗逆性更強(qiáng)，越冬前11月上旬挖蛹預(yù)埋，越冬后的死亡率高達(dá)84.5%;而越冬后4月上旬挖蛹，以同樣的方法預(yù)埋，其死亡率僅為34.5%。進(jìn)而表明，經(jīng)過(guò)自然低溫的冷馴化，柑桔大實(shí)蠅的抗寒能力增強(qiáng)了，亦即，抵御早春突發(fā)低溫危害的能力更強(qiáng)了 (Lee et al.，1987;Maureen and Richard，1990)。

近年來(lái)，在大量的昆蟲抗寒性研究中，過(guò)冷卻點(diǎn)已經(jīng)成為評(píng)價(jià)昆蟲耐寒性強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)，但某些昆蟲的大量死亡常出現(xiàn)在過(guò)冷卻點(diǎn)以上的亞致死溫度 (Maureen and Richard，1990)，因此過(guò)冷卻點(diǎn)并非評(píng)價(jià)昆蟲耐寒性的唯一指標(biāo)，亦不能作為昆蟲存活的下限溫度;除過(guò)冷卻點(diǎn)以外，界定昆蟲耐寒性的指標(biāo)還有昆蟲的體液結(jié)冰點(diǎn)和低溫存活能力等 (Bale，1996;Nedved et al.，1998;Chen and Kang，2002;Renault et al.，2002)。本研究結(jié)果表明，柑桔大實(shí)蠅滯育蛹和滯育解除蛹的過(guò)冷卻點(diǎn)均較老熟幼蟲的低，而范京安等(1994)的研究指出，柑桔大實(shí)蠅蛹的抗寒能力較老熟幼蟲弱，老熟幼蟲在0℃條件下可成活20 d以上，少數(shù)可達(dá)29 d;在3℃時(shí)，93%以上的老熟幼蟲能完成化蛹，死亡率極低;而蛹在3℃處理30 d后全部死亡，6℃處理30 d，只有26.6%的蛹能羽化為成蟲，這可能與蛹解除滯育后暴露在低溫環(huán)境中有關(guān) (范京安等，1994)。Renault等 (2002)的研究顯示，即使在其過(guò)冷卻點(diǎn)以上的低溫環(huán)境中，暴露較長(zhǎng)的時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致昆蟲的死亡，這可能與幼蟲和蛹經(jīng)過(guò)低溫馴化后獲得的抗寒能力的大小不同有關(guān)。本文結(jié)果中老熟幼蟲的結(jié)冰點(diǎn)和過(guò)冷卻點(diǎn)之間的差值最大，這種差值的大小是否與其在低溫馴化過(guò)程中獲得的抗寒能力的大小有關(guān)?尚有待進(jìn)一步研究。

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