李陽　朱靈　朱燦燦　趙樹彌　張龍　鄧國慶　劉勇　王安

[摘 要] 針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）檢測的問題，發(fā)展一種基于微流控?zé)晒舛縋CR的致病菌快速檢測新技術(shù)。采用光刻法制作了微流控PCR芯片，研制了集成高性能溫度控制模塊和高靈敏度熒光檢測模塊的微流控?zé)晒舛縋CR分析系統(tǒng)。通過檢測特異性基因femA和mecA對MRSA進行快速鑒別。實驗結(jié)果表明，使用微流控PCR芯片可以成功實現(xiàn)MRSA特異性基因的快速檢測，相對傳統(tǒng)的管式PCR，芯片使用6 ?L試劑在56 min完成了MRSA特異基因的檢測，不僅節(jié)約了反應(yīng)試劑，而且極大提高了檢測速度。該技術(shù)可擴展到其他致病菌的檢測，具有良好的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞] 微流控芯片；熒光定量PCR；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；快速檢測

中圖分類號：TB99 R378.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：2055-5200（2014）02-006-03

前 言

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus， MRSA）是引起院內(nèi)感染的主要病原菌之一，MRSA具有耐藥性和致病能力強的特點易引起交叉感染，極大地增加了臨床治療難度 [1]。 MRSA檢測的常用方法有紙片擴散法、瓊脂稀釋法、PCR擴增電泳法等[2-4]，但是這些方法耗時長、需要樣本量多、實驗成本高、操作復(fù)雜。因此，研究針對MRSA的快速、準(zhǔn)確檢測方法具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，femA基因是金葡菌攜帶的特異性基因，而MRSA的耐藥性是由于其攜帶的mecA基因編碼對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物低親和力的青霉素結(jié)合蛋白（PBP2a）而產(chǎn)生的。使用PCR方法同時檢測femA和mecA基因可提高MRSA鑒別的特異性[5]。管式熒光定量PCR方法進行金葡菌的檢測需要2個多小時的時間[6-7]，微流控技術(shù)通過微加工工藝在芯片上制作微型PCR反應(yīng)腔，可極大減少PCR反應(yīng)體系，節(jié)約試劑，提高升降溫速度，從而實現(xiàn)快速檢測[8-9]。

本文采用光刻法制作了PDMS微流控PCR芯片，在自主研發(fā)的集成高性能溫度控制模塊和高靈敏度熒光檢測模塊的微流控?zé)晒舛縋CR分析系統(tǒng)上實現(xiàn)了MRSA的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

實驗所用的儀器及試劑：勻膠機（中科院微電子所 KW-4A型）；紫外曝光機（美國Uvitron International公司 INTELLI-RAY 400型）；微電腦加熱板（PERSDER公司）；SU8 2150光刻膠（美國MicroChem公司）；等離子體清洗機（美國Harrick Plasma公司 PDC-32G型）；PDMS（Dow Corning公司 Silgard 184）；TEC （富連京公司 FPH1-19912ACS1型）；MRSA試劑盒（寧波基內(nèi)公司）。

研究中使用的PCR平臺是自主研制的微流控?zé)晒舛縋CR系統(tǒng)，該系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)原理圖如圖1所示。系統(tǒng)包括溫度控制模塊、熒光檢測模塊和計算機。溫度控制模塊由半導(dǎo)體制冷片、散熱器及風(fēng)扇組成，結(jié)構(gòu)如圖2所示。半導(dǎo)體制冷片（Thermoelectric Cooler，TEC）具有加熱和制冷兩種功能，熱管鰭片式高性能散熱器以及風(fēng)扇是將TEC 產(chǎn)生的熱量充分散發(fā)至周圍環(huán)境中，通過優(yōu)化設(shè)計后的溫度控制算法可實現(xiàn)溫度的精確控制[10]。

熒光檢測模塊利用LED作為激發(fā)光源，通過CCD（ICX412，SONY公司）對PCR過程所發(fā)出的熒光信號進行收集，傳輸?shù)接嬎銠C中進行分析處理。

1.2 芯片結(jié)構(gòu)與加工

微流控芯片如圖3所示包含兩層結(jié)構(gòu)，上層是通過光刻方法制作的PDMS基片，利用氧等離子體與下層的玻璃板鍵合。硅片上陽模板的制作：2英寸的硅片利用等離子體清洗后涂以光刻膠，先500 r/min勻膠10 s，再1700 r/min勻膠30 s；前烘過程的溫度設(shè)置為65 ℃→95 ℃→65 ℃，三個階段的時間分別為8 min，80 min和10 min；在紫外曝光機中曝光15 s；后烘的溫度設(shè)置為65 ℃→95 ℃→65 ℃，時間為5 min，25 min和5 min；硅片與顯影液（丙酮）中超聲顯影15 min，顯影后晾干備用。

圖1 微流控?zé)晒釶CR平臺結(jié)構(gòu)圖

圖2 溫度控制結(jié)構(gòu)圖

將PDMS與固化劑按照質(zhì)量比10：1進行混合，攪拌均勻，經(jīng)抽真空后倒在微流控芯片模板上，置于微加熱板上85 ℃固化1h；自然冷卻后，將PDMS基片從模板上剝離下來，在反應(yīng)腔的兩端引流通道打孔；將打孔后的PDMS基片與玻璃基板用等離子體進行鍵合；鍵合好的芯片進行高溫高壓滅菌處理，再烘干。

圖3 微流控芯片結(jié)構(gòu)圖

1.3 微流控PCR實驗

PCR反應(yīng)試劑按照PCR試劑盒說明進行配制。20.2 ?L的反應(yīng)體系包括18 ?L的MRSA耐藥基因核酸熒光PCR檢測混合液與0.2 ?L酶（Taq+UNG）以及2 ?L的DNA模板（濃度為0.4 ng/?L）。從20.2 ?L的體系中抽取6 ?L注入微流控芯片中，密封芯片。在微流控?zé)晒釶CR平臺上進行PCR反應(yīng)。條件設(shè)置如下：37 ℃運行2 min，94 ℃預(yù)變性2 min；然后進行PCR擴增，93 ℃變性12 s，60 ℃延伸45 s，循環(huán)40個周期。

2 結(jié)果與討論

我們對PCR循環(huán)過程中微流控芯片反應(yīng)腔內(nèi)部的溫度和TEC的溫度進行了測定，所得到的結(jié)果如圖（4）所示。從圖中可以看出，TEC通過分段超前校正算法進行控制，從而使芯片中的PCR試劑能夠?qū)崿F(xiàn)快速的升降溫。目前，平均升降溫速率達到7.48 ℃/s，其中升溫速率為11.25 ℃/s，降溫速率為5.08 ℃/s。管式熒光定量PCR儀，其負(fù)載的升降溫速率為2℃/s，單次實驗需要2h以上才能完成整個PCR反應(yīng)。本研究利用微流控?zé)晒釶CR的方法，56 min就完成了MRSA的檢測，反應(yīng)時間縮短至1h以內(nèi)，主要原因在于快速的升降溫速度使得PCR循環(huán)中各個溫區(qū)之間切換時間大大縮短。

圖4 PCR溫度循環(huán)中芯片內(nèi)部溫度和TEC的溫度曲線

將濃度為0.4 ng/?L的MRSA基因工程菌加入6 ?L微流控芯片，進行了5次PCR實驗 ，擴增曲線如圖（5）所示，兩個基因片段的Ct值分別為13.48和18.60，被測基因femA和mecA都有明顯的擴增，可以確認(rèn)待測樣品即為MRSA陽性樣品。相對于試劑盒推薦使用的40 ?L PCR反應(yīng)體系，微流控芯片的試劑量縮小至原來的1/6。本研究采用的PDMS芯片制作簡單、成本較低，而且具有很好的生物兼容性，這使得MRSA檢測成本大大降低。同時，針對不同的待測樣本量，使用光刻法可以制作不同通量的微流控PCR芯片，既可對單個樣本進行檢測，又可以同時檢測多個待測樣本，而且通過改變PCR反應(yīng)腔的大小，甚至能夠?qū)崿F(xiàn)納升乃至皮升體積的微流體PCR反應(yīng)。

3 結(jié)論

本研究將微流控芯片和熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了MRSA的快速檢測。芯片采用高性能溫度控制模塊進行加熱，該溫度控制模塊有較快的升降溫速率，可以減少微流控芯片在升降溫過程中消耗的時間，加快PCR反應(yīng)速度。微流控PCR芯片反應(yīng)腔體積和反應(yīng)腔形狀可以根據(jù)實際樣本檢測的需要進行個性化設(shè)計，通過MEMS技術(shù)PCR反應(yīng)腔可以縮小至微升級乃至納升級，在同樣大小芯片上可以刻上更多的反應(yīng)腔，從而提高檢測通量。本方法不僅可以用于致病菌的快速檢測，在其他病原體基因檢測中也有著廣泛的應(yīng)用。

參 考 文 獻

[1] 楊清宇，劉榮森. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2004， 14（4）：478-480.

[2] 晏群，鄔靖敏，李軍，等. 6種檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方法的應(yīng)用評價[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（026）：65-69.

[3] 張鳳笑，石磊.PCR 技術(shù)在金黃色葡萄球菌中的研究進展[J].現(xiàn)代食品科技. 2008，24（10）：1042-1047.

[4] 牟曉峰，趙自云. 實時熒光定量 PCR 檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方法的建立與應(yīng)用評價[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志.，2011，21（19）：4185-4187.

[5] 陳智鴻，范昕建，呂曉菊. mecA，femA 基因 PCR 聯(lián)合擴增法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[J]. 四川大學(xué)學(xué)報 （醫(yī)學(xué)版）： 2003，34（4）：663-666.

[6] 朱以軍，李向陽. 熒光實時 PCR 法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17（7）：898-900.

[7] 姚李英，陳濤，王升啟等.高聚物基 PCR 微流控芯片技術(shù)[J].中國生物工程雜志，2004，24（3）：90-93.

[8] Ramalingam N，Rui Z，Liu HB，et al. Real-time PCR-based microfluidic array chip for simultaneous detection of multiple waterborne pathogens[J]. Sensors and Actuators B： Chemical. 2010，145（1）：543-552.

[9] Qiu X，Mauk MG，Chen D，Liu C，Bau HH. A large volume，portable，real-time PCR reactor[J]. Lab Chip. 2010，10（22）：3170-3077.

[10] 劉勇，高娜，李志剛，等. 基于分段式超前校正的微流控 PCR 溫度控制器[J].傳感器與微系統(tǒng)，2012，31（9）：93-95.

圖4 PCR溫度循環(huán)中芯片內(nèi)部溫度和TEC的溫度曲線

將濃度為0.4 ng/?L的MRSA基因工程菌加入6 ?L微流控芯片，進行了5次PCR實驗 ，擴增曲線如圖（5）所示，兩個基因片段的Ct值分別為13.48和18.60，被測基因femA和mecA都有明顯的擴增，可以確認(rèn)待測樣品即為MRSA陽性樣品。相對于試劑盒推薦使用的40 ?L PCR反應(yīng)體系，微流控芯片的試劑量縮小至原來的1/6。本研究采用的PDMS芯片制作簡單、成本較低，而且具有很好的生物兼容性，這使得MRSA檢測成本大大降低。同時，針對不同的待測樣本量，使用光刻法可以制作不同通量的微流控PCR芯片，既可對單個樣本進行檢測，又可以同時檢測多個待測樣本，而且通過改變PCR反應(yīng)腔的大小，甚至能夠?qū)崿F(xiàn)納升乃至皮升體積的微流體PCR反應(yīng)。

3 結(jié)論

本研究將微流控芯片和熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了MRSA的快速檢測。芯片采用高性能溫度控制模塊進行加熱，該溫度控制模塊有較快的升降溫速率，可以減少微流控芯片在升降溫過程中消耗的時間，加快PCR反應(yīng)速度。微流控PCR芯片反應(yīng)腔體積和反應(yīng)腔形狀可以根據(jù)實際樣本檢測的需要進行個性化設(shè)計，通過MEMS技術(shù)PCR反應(yīng)腔可以縮小至微升級乃至納升級，在同樣大小芯片上可以刻上更多的反應(yīng)腔，從而提高檢測通量。本方法不僅可以用于致病菌的快速檢測，在其他病原體基因檢測中也有著廣泛的應(yīng)用。

參 考 文 獻

[1] 楊清宇，劉榮森. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2004， 14（4）：478-480.

[2] 晏群，鄔靖敏，李軍，等. 6種檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方法的應(yīng)用評價[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（026）：65-69.

[3] 張鳳笑，石磊.PCR 技術(shù)在金黃色葡萄球菌中的研究進展[J].現(xiàn)代食品科技. 2008，24（10）：1042-1047.

[4] 牟曉峰，趙自云. 實時熒光定量 PCR 檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方法的建立與應(yīng)用評價[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志.，2011，21（19）：4185-4187.

[5] 陳智鴻，范昕建，呂曉菊. mecA，femA 基因 PCR 聯(lián)合擴增法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[J]. 四川大學(xué)學(xué)報 （醫(yī)學(xué)版）： 2003，34（4）：663-666.

[6] 朱以軍，李向陽. 熒光實時 PCR 法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17（7）：898-900.

[7] 姚李英，陳濤，王升啟等.高聚物基 PCR 微流控芯片技術(shù)[J].中國生物工程雜志，2004，24（3）：90-93.

[8] Ramalingam N，Rui Z，Liu HB，et al. Real-time PCR-based microfluidic array chip for simultaneous detection of multiple waterborne pathogens[J]. Sensors and Actuators B： Chemical. 2010，145（1）：543-552.

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[10] 劉勇，高娜，李志剛，等. 基于分段式超前校正的微流控 PCR 溫度控制器[J].傳感器與微系統(tǒng)，2012，31（9）：93-95.

圖4 PCR溫度循環(huán)中芯片內(nèi)部溫度和TEC的溫度曲線

將濃度為0.4 ng/?L的MRSA基因工程菌加入6 ?L微流控芯片，進行了5次PCR實驗 ，擴增曲線如圖（5）所示，兩個基因片段的Ct值分別為13.48和18.60，被測基因femA和mecA都有明顯的擴增，可以確認(rèn)待測樣品即為MRSA陽性樣品。相對于試劑盒推薦使用的40 ?L PCR反應(yīng)體系，微流控芯片的試劑量縮小至原來的1/6。本研究采用的PDMS芯片制作簡單、成本較低，而且具有很好的生物兼容性，這使得MRSA檢測成本大大降低。同時，針對不同的待測樣本量，使用光刻法可以制作不同通量的微流控PCR芯片，既可對單個樣本進行檢測，又可以同時檢測多個待測樣本，而且通過改變PCR反應(yīng)腔的大小，甚至能夠?qū)崿F(xiàn)納升乃至皮升體積的微流體PCR反應(yīng)。

3 結(jié)論

本研究將微流控芯片和熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了MRSA的快速檢測。芯片采用高性能溫度控制模塊進行加熱，該溫度控制模塊有較快的升降溫速率，可以減少微流控芯片在升降溫過程中消耗的時間，加快PCR反應(yīng)速度。微流控PCR芯片反應(yīng)腔體積和反應(yīng)腔形狀可以根據(jù)實際樣本檢測的需要進行個性化設(shè)計，通過MEMS技術(shù)PCR反應(yīng)腔可以縮小至微升級乃至納升級，在同樣大小芯片上可以刻上更多的反應(yīng)腔，從而提高檢測通量。本方法不僅可以用于致病菌的快速檢測，在其他病原體基因檢測中也有著廣泛的應(yīng)用。

參 考 文 獻

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[2] 晏群，鄔靖敏，李軍，等. 6種檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方法的應(yīng)用評價[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（026）：65-69.

[3] 張鳳笑，石磊.PCR 技術(shù)在金黃色葡萄球菌中的研究進展[J].現(xiàn)代食品科技. 2008，24（10）：1042-1047.

[4] 牟曉峰，趙自云. 實時熒光定量 PCR 檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方法的建立與應(yīng)用評價[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志.，2011，21（19）：4185-4187.

[5] 陳智鴻，范昕建，呂曉菊. mecA，femA 基因 PCR 聯(lián)合擴增法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[J]. 四川大學(xué)學(xué)報 （醫(yī)學(xué)版）： 2003，34（4）：663-666.

[6] 朱以軍，李向陽. 熒光實時 PCR 法檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17（7）：898-900.

[7] 姚李英，陳濤，王升啟等.高聚物基 PCR 微流控芯片技術(shù)[J].中國生物工程雜志，2004，24（3）：90-93.

[8] Ramalingam N，Rui Z，Liu HB，et al. Real-time PCR-based microfluidic array chip for simultaneous detection of multiple waterborne pathogens[J]. Sensors and Actuators B： Chemical. 2010，145（1）：543-552.

[9] Qiu X，Mauk MG，Chen D，Liu C，Bau HH. A large volume，portable，real-time PCR reactor[J]. Lab Chip. 2010，10（22）：3170-3077.

[10] 劉勇，高娜，李志剛，等. 基于分段式超前校正的微流控 PCR 溫度控制器[J].傳感器與微系統(tǒng)，2012，31（9）：93-95.