曹毅，宋紅麗（1.天津醫(yī)科大學一中心臨床學院，天津300192；2.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津300192）

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BM MSCs）作為一種易分離、純化、體外擴增、多能分化的干細胞，在細胞因子的幫助下可以增殖、遷移，分化成肝細胞并具有其功能，同時擁有弱的免疫原性。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）可以感染BM MSCs并在其內表達，導致其增殖匱乏，但不會影響它的免疫表型、向肝細胞分化并具有肝細胞樣作用的能力。同時BM MSCs可以通過消除在其細胞內的HBV而抵制其長期感染機體。所以研究者們考慮使用BM MSCs移植療法來治療乙型肝炎晚期肝硬化、肝癌的患者，有效減輕排斥反應，為今后的臨床應用提供更合適的方法。

BM MSCs是屬于中胚層的一類多能干細胞，具有易分離、純化、體外擴增，自我更新及多向分化能力強、免疫原性弱、移植后很少發(fā)生免疫排斥反應和不涉及倫理問題等特點，在細胞治療和組織器官重建方面的研究中具有廣泛的應用前景。病毒性肝炎是一種嚴重威脅人類健康的常見病，特別是HBV所引起的乙型肝炎。全球約有3億以上慢性病毒性肝炎及其病毒攜帶者，而我國約有1.2億慢性病毒性肝炎感染者。目前原位肝移植是治療各種肝功能失代償期、肝衰竭最有效的治療方法，但因為肝源缺乏、費用昂貴、以及移植后的并發(fā)癥等限制了其廣泛應用。近年來，新的干預性治療通過利用外源性的BM MSCs移植來達到幫助損傷組織或細胞修復與再生的目的。本文圍繞BM MSCs的特性、它與HBV的相互作用，其移植入體內的影響的國內外最新研究進展進行綜述。

1 BM MSCs的特性、來源、體外培養(yǎng)與應用

1.1 BM MSCs的發(fā)現(xiàn)、特性及應用

1867年，Cohnheim在研究傷口愈合時，首次提出骨髓中存在非造血干細胞，指出成纖維母細胞可能來源于骨髓。1976年，F(xiàn)riedenstein等［1］從骨髓細胞中培養(yǎng)出這種纖維原細胞，并證實其易貼壁、在體外大量擴增、呈集落樣生長，并具有定向分化的特點。1997 年 Prockop［2］、1999 年 Pittenger等［3］先后分別證明了這種纖維原黏附細胞中包含間充質干細胞，具有分化為多種間質組織（如骨、軟骨、脂肪和平滑?。┑哪芰Αｈb于這些特點，人們把這群細胞命名為BM MSCs。

BM MSCs是一種具有特征性形態(tài)、表型及功能性質的細胞，它能夠強表達CD13、CD29、CD44、CD105， 弱 表 達 CD106， 不 表 達 CD14、CD34、CD11a、CD31、CD45［3］及人類白細胞抗原（HLA）Ⅰ抗原和HLAⅡ抗原［4］，不表達或低表達移植免疫排斥相關的表面標志 CD80（B7-1）、CD86（B7-2）、CD40、CD40L［5］。其中，CD29屬于整合素家族，CD105是間充質相關抗原，CD14是單核/巨噬細胞表面標志，CD11a是淋巴細胞功能相關抗原-1，CD34和CD45是造血干細胞（HSC）表面標志，CD31是內皮細胞特異性抗原標志。說明BM MSCs不具備造血干細胞、內皮細胞及移植排斥的特性。

BM MSCs是造血微環(huán)境中的主要細胞成分，通過分泌多種細胞因子，如缺氧誘導因子-1a（HIF-1a），誘導產(chǎn)生干細胞生長因子保護細胞和組織［6］；或表達與HSC黏附、歸巢有關的黏附分子及細胞外基質（ECM）蛋白［5］，對HSC的生長、增殖、分化起著重要作用。BM MSCs、臍血CD34+HSC和銅螯合劑共培養(yǎng)使HSC增殖明顯增加［7］。Koh等［8］發(fā)現(xiàn)BM MSCs可能在HSC表觀遺傳調控中也起了一定的作用。

BM MSCs具有在體外容易擴增的特性，在短時間內可以擴增上千倍。這是BM MSCs廣泛應用于實驗研究和臨床的重要前提。

BM MSCs具有多向分化潛能，在特定的誘導條件下，它不僅能分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱等中胚層組織細胞，而且能夠向外胚層組織細胞（如神經(jīng)細胞［9］、尿道上皮細胞［10］）和內胚層組織細胞（如心肌細胞［11］、肝細胞［12］）分化。Wakitani等［13］將體外擴增的BM MSCs輸注給24例進行了高位脛骨切開的膝關節(jié)炎患者，42周后缺損部位已被軟組織填充并有軟骨樣組織形成。所以BM MSCs可以用于骨組織工程，參與組織修復。Rodrigo等［14］發(fā)現(xiàn)間充質干細胞植入到急性心肌梗死的患者身上是方便且安全的，它能促進血管和心肌細胞的再生。體外的BM MSC可以通過加入細胞因子［15］、與肝細胞或類固醇激素［16-17］混合培養(yǎng)轉化成肝細胞、刺激內皮細胞再生、增強纖維基質降解，同時擁有肝細胞的功能。當然所分化細胞所在器官特殊的微環(huán)境是BM MSCs分化的最適合條件［16］。

1.2 BM MSCs的體外培養(yǎng)

BM MSCs易分離、純化，其體外分離方法主要有四種：① 密度梯度離心法。② 貼壁篩選法。③ 流式細胞儀分選法。④ 免疫磁珠分選法。其中貼壁篩選法操作簡單，對細胞損傷較少，被廣泛應用［18］。

體外培養(yǎng)的BM MSCs體積比較小，核仁明顯，培養(yǎng)時貼壁，可聚集成均勻的集落，生長曲線呈“S”型［19］，擴增一代和兩代后的細胞同質性分別達到95%和98%。細胞的大小、形態(tài)和匯合度可以用倒置顯微鏡來觀察。脂肪誘導和成骨誘導可以驗證BM MSCs生長效果。脂肪的誘導分化通過油紅O染色作為20天后細胞內脂質堆積的指示。成骨的誘導分化用堿性磷酸酶檢測14天后誘導效果。茜素紅染色作為21天后細胞外基質鈣化的指示［20］。

1.3 細胞因子與BM MSCs的關系

細胞因子包括白細胞介素（IL）、干擾素（INF）、腫瘤壞死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）、生長因子（GF）和趨化性細胞因子六大類。

BM MSCs分泌有大量的GF，包括成纖維細胞生長因子（FGF）、血小板源性生長因子（PDGF）、胰島素樣生長因子（IGF-1）、表皮生長因子（EGF）、肝細胞生長因子（HGF）、轉化生長因子等［21］。基質細胞衍生因子 1（SDF-1）/CXCR4軸［22］、PDGF、EGF 及其配體肝素［23-24］可以使調整BM MSCs遷移，使其生存能力和增殖能力顯著提高，促進血管生成細胞因子分泌，如堿性成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子。Western bloting和實時聚合酶鏈反應（RT-PCR）顯示SDF-1預處理可以激活具有促進生長的蘇氨酸激酶和細胞外調節(jié)蛋白激酶相關的信號轉導通路，上調B細胞淋巴瘤-2/B細胞淋巴瘤相關蛋白的比值。FGF4和HGF通過有絲分裂活化蛋白激酶細胞信號途徑（MAPK cell-signing pathway）提高BM MSCs分化成肝細胞的能力［25］。門脈注射人HGF基因修飾的BM MSCs后，免疫排斥反應受到抑制，肝功能顯著改善，IL-2、IFN-γ水平降低，IL-4和IL-10水平增加，細胞凋亡水平降低，增殖細胞核抗原的表達水平增加，大鼠生存時間延長。并發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白不會影響B(tài)M MSCs的作用［26］。值得注意的是所有細胞因子與BM MSCs的作用都是在具有充分血清營養(yǎng)的前提下發(fā)揮的［27］。

2 HBV與BM MSCs之間的作用關系

Ma等［28］第一次發(fā)現(xiàn)人BM MSCs能支持挑剔的HBV感染、復制、表達和藏匿，且HBV感染后BM MSCs形態(tài)不變。由于病毒基因通過整合或者轉染而不是感染進入細胞，所以BM MSCs比Hep G2更適合作為查看HBV生命周期和原始病毒與細胞相互作用機制的工具。BM MSCs用HBV陽性血清培養(yǎng)的1天后，細胞內、外乙肝病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）、乙肝病毒的共價環(huán)狀閉合脫氧核糖核酸（cccDNA），培養(yǎng)基中乙肝表面抗體（HBsAg）、乙肝核心抗體（HBcAg）、乙肝e抗體（HBeAg）等相繼出現(xiàn)，并且發(fā)現(xiàn)HBV體外感染 BM MSC 與人初級肝細胞［29］和人肝癌細胞株［30-31］相比，不同的地方在于HBcAg的高表達。結果顯示存在于BM MSC中的病毒部分是半徑50 ～200 nm的球形。這些病毒成分、HBsAg及HBcAg存在于細胞的細胞質中，提示HBV在細胞中已經(jīng)發(fā)生轉錄并表達抗原。

HBV抑制BM MSCs的體外擴增，但不會影響B(tài)M MSCs的免疫表型、向肝細胞分化并具有肝細胞樣作用的能力［32］。Zhong 等［20］收集 15 份來自于慢性乙型肝炎和肝硬化患者的BM MSCs、11份來自于有著同樣的年齡結構的健康人的BM MSCs進行體外培養(yǎng)。用RT-PCR分析，BM MSCs及其生存的培養(yǎng)基中均未檢測到HBV DNA和mRNA的存在，但細胞上的PDGF-α、PDGF-β、IGF-1和堿性成纖維細胞生長因子表達都減少。排除年齡因素后，GF表達的減少造成患者BM MSCs的增殖減少。需要進一步的研究評估慢性乙型肝炎患者更多的GF和其BM MSCs上細胞因子的多樣性。

BM MSCs對HBV有抵抗力，在BM MSCs中檢測不到cccDNA基因組和前RNA基因組，提示HBV不能在BM MSCs或內皮祖細胞中復制［33］。Xie等［34］對乙肝患者體外培養(yǎng)至第3、4、5代的BM MSCs進行檢測發(fā)現(xiàn)，細胞內、外及其培養(yǎng)基中HBV DNA、HBsAg和HBcAg均顯示陰性。健康人的BM MSCs及其第6、12、18天誘導的類肝細胞在含有HBV的血清感染環(huán)境下培養(yǎng)48小時，大約80%的細胞免于感染。胡維亨和任軍［32］觀察HBV陽性血清培養(yǎng)的人BM MSCs大約半數(shù)以上擴增受阻，但是只有不到5%的細胞可以檢測到病毒表達。所以他從這份低病毒表達率上得出結論，BM MSCs對HBV是有抵抗的。

Rong等［33］發(fā)現(xiàn) BM MSCs能吞噬 HBV，幫助它進入受傷的組織中。

3 BM MSCs移植療法治療乙肝終末期肝病

BM MSCs是一類免疫缺陷細胞，可以抑制T細胞的增殖和激活，通過可溶性因子的介導來發(fā)揮免疫調節(jié)功能，實驗發(fā)現(xiàn)轉化生長因子（TGF-β）、前列腺素 E2（PGE2）、吲哚胺雙加氧酶（IDO）［35］等因子可能參與BM MSCs的免疫調節(jié)，減少免疫排斥反應的發(fā)生。

肝硬化是肝病的晚期階段。而肝硬化的主要病理變化就是肝纖維化。肝纖維化是指細胞外基質（ECM）積累過多和受傷區(qū)域的疤痕組織的形成。在受傷的肝臟中，活化的肝星狀細胞（HSC）是主要的ECM產(chǎn)生細胞，能夠合成大量的細胞基質蛋白。BM MSCs能誘導活化的HSC凋亡而終止肝硬化進展［36］。Mohamadnejad 等［37］治療4例晚期肝硬化患者，體外培養(yǎng)BM MSCs經(jīng)肘靜脈注射回患者體內。所有患者均無死亡及并發(fā)癥出現(xiàn)。Sakaida等［38］將自體骨髓細胞移植入用標記著綠色熒光蛋白的四氯化碳（GFP/CCl4）誘導的小鼠肝硬化模型，移植的細胞在損傷的肝組織內有效增殖分化為肝細胞，改善肝臟功能，提高了患病小鼠的生存率。Parekkadan等［39］發(fā)現(xiàn)BM MSCs可以分泌多種細胞因子，促進肝細胞增殖及肝臟血管再生，促進免疫細胞增殖并向肝臟遷移，提高了大鼠生存率。Peng等［40］的研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎引起的肝衰竭患者自體BM MSCs移植是安全的，短期明顯改善肝臟功能，但長期的肝細胞性肝癌發(fā)病率或病死率沒有顯著差異。

自體移植后的排斥反應很弱，可以克服臨床上的移植排斥問題。異種移植的免疫反應比自體移植的要強烈些，但也比肝移植的免疫排斥弱得多。而且BM MSCs容易獲得，并能在體內廣泛分化而不涉及倫理問題，對于肝臟來說以BM MSCs為基礎的治療比其他干細胞都適合。但需注意的是由于BM MSCs能吞噬HBV，幫助它進入受傷的組織中，可能引起乙肝反彈。所以我們不能給有其他組織受傷的乙肝患者進行BM MSCs的移植。

4 總 結

BM MSCs移植是藥物治療和手術治療之后的又一場醫(yī)療革命。病毒性肝炎及其晚期肝硬化、肝癌是嚴重威脅人類健康的常見病，2004至2012年我國共報告病毒性肝炎發(fā)病數(shù)13 501 863例，年均發(fā)病率為112.960/10萬，年均死亡率為1.007/10萬，在5種類型肝炎中，乙肝發(fā)病數(shù)最多，占病毒性肝炎傳染病總數(shù)的82.125%［41］。因為肝源缺乏、費用昂貴、以及移植后的并發(fā)癥等限制了原位肝移植的廣泛應用。所以外源性BM MSCs移植將成為未來的新興的治療方法。不過要實現(xiàn)將BM MSCs移植應用于臨床上，還有很多的關鍵問題需要解決，例如，如何處理BM MSCs移植后的乙肝再感染問題，BM MSCs感染HBV后的產(chǎn)物能否在人體內獲得容許存在下去。BM MSCs轉化成肝細胞后，是否表達主要組織相容性抗原，發(fā)揮免疫調控［42］。如何保持間充質干細胞經(jīng)過體外大規(guī)模培養(yǎng)后的分化能力、遺傳特征、致瘤性和穩(wěn)定性；如何建立干細胞產(chǎn)品的技術標準及質量評價體系等等。另外，建立健全規(guī)范的法律法規(guī)和統(tǒng)一的生產(chǎn)和質量標準也是發(fā)展間充質干細胞技術的關鍵。只有通過嚴格的臨床試驗審查，才能防止損害公眾利益的事情發(fā)生。