楊佳亮 ，傅勝才 ，楊 青

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410131）

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌疫苗在斷奶仔豬中的應用

楊佳亮1，2，傅勝才2，楊 青1，※

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410131）

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)是引起新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的主要病原之一。通過免疫母豬，新生仔豬通常可以從初乳和乳汁得到有效保護，但在斷奶階段，母乳的保護消失。有關研究發(fā)現(xiàn)，引起斷奶仔豬腹瀉常見的ETEC菌株均有菌毛F4或F18。這些菌毛是重要的毒力因子，它們使細菌結(jié)合到宿主易感腸上皮細胞，在腸內(nèi)定植繁殖，隨后分泌腸毒素引起腹瀉。文章針對由菌毛F4和/或F18產(chǎn)毒素大腸桿菌引起的腹瀉，概括了在養(yǎng)豬生產(chǎn)中其相關免疫接種途徑，包括口服弱毒苗和亞單位疫苗、膠囊疫苗和注射免疫接種等。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌；菌毛；免疫；斷奶仔豬

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起人、豬和牛腸道感染的的一個主要病原之一。在新生仔豬和斷奶仔豬中，ETEC引起的腹瀉可導致高的發(fā)病率和死亡率，造成巨大的經(jīng)濟損失。菌毛，又稱為粘附素，是ETEC表面的一種纖毛樣物,通過與宿主小腸上皮細胞特異受體結(jié)合,使得細菌在腸黏膜上定植并繁殖產(chǎn)生腸毒素從而導致腹瀉[1]。在豬中，五種ETEC菌毛與腹瀉有關，分別是：F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F7(F41)和F18。在發(fā)生腹瀉和死亡的新生仔豬、哺乳期仔豬以及剛斷奶的仔豬中，F(xiàn)4菌毛最常見。而F5、F6和F41主要與新生兒腹瀉有關，F(xiàn)18菌毛則與斷奶仔豬腹瀉密切相關。F4菌毛的抗原突變體有F4ab、F4ac和F4ad，其中F4ac是目前最常見的。F18有F18ab和F18ac突變體，其中F18ac與斷奶仔豬腹瀉密切相關，而F18ab主要與水腫性疾病相關[2]。

ETEC在腸道內(nèi)定植后生長增殖，隨后釋放腸毒素引發(fā)細胞內(nèi)水、電解質(zhì)失衡導致水樣腹瀉。ETEC分泌的腸毒素包括不耐熱腸毒素（LT）、耐熱腸毒素 a（STa）、耐熱腸毒素 b（STb）和腸聚集熱穩(wěn)定腸毒素1（EAST1）[3]。雖然大多數(shù)新生仔豬可以通過免疫后母豬的初乳和乳汁獲得保護，但是ETEC感染非侵入性胃腸道感染，因此粘膜免疫比系統(tǒng)免疫更為重要。目前市場上有幾種疫苗，包括：帶菌毛的滅活菌、帶LT的純化菌毛或不帶LT的純化菌毛菌應用懷孕母豬。但隨著母豬年齡的增大，通過這些疫苗所獲得免疫逐漸降低；而且在斷奶時催乳免疫突然消失，導致剛斷奶的仔豬很容易感染腸桿菌。為了保護剛斷奶的仔豬，積極的腸道粘膜免疫應答尤為重要。

1 口服亞單位疫苗的應用

在感染時，由于菌毛在細菌定植的過程中扮演著至關重要的角色，使得口服菌毛疫苗的研發(fā)發(fā)展迅速。純化的F4ac菌毛是一種很強的口服免疫原，在斷奶仔豬中，連續(xù)兩天口服1mg后，在第4、7、8和11天可分別導致派伊爾淋巴集結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、血液和固有膜中分泌F4特異性抗體的細胞出現(xiàn)，所誘導產(chǎn)生的IgA應答可與口服感染ETEC產(chǎn)生的應答相比。當斷奶仔豬連續(xù)3天接種口服疫苗并在初免后第16天加強免疫一次，可以完全能預防口服含F(xiàn)4菌毛的ETEC所致的感染。Joensuu等人建議可用轉(zhuǎn)基因食用苜蓿植物作為F4菌毛粘附和主要亞單位FaeG的載體，這樣既安全又廉價，但研究表明效果不是很理想[4]。

與菌毛F4相比，當用F18大腸桿菌感染時，口服純化的F18不能誘導產(chǎn)生保護性的免疫應答，當F18菌毛劑量達30mg并聯(lián)合使用粘膜佐劑LT（R139G）也不能產(chǎn)生保護效果[5]。這兩種菌毛所產(chǎn)生的免疫原性差異可能它們的結(jié)構相關。F18的粘附素是小亞基FedF，然而F4菌毛的粘附素主要菌毛大亞基FaeG。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，當斷奶仔豬口服重組FedF并聯(lián)合使用F4菌毛時，能減少糞便中F18陽性大腸桿菌的排泄。這種聯(lián)合疫苗的研發(fā)開啟了一種對抗F4和F18感染的新途徑[2]。

2 口服活疫苗的應用

口服弱毒苗和野生型無致病大腸桿菌活苗是ETEC疫苗接種的另外一種好的途徑。當動物口服這些疫苗后，疫苗菌粘附到小腸細胞觸發(fā)產(chǎn)生免疫應答，并迅速產(chǎn)生特異性抗原sIgA抗體，阻止產(chǎn)生同類菌毛的致病性菌的繁殖?？葿ozic等人報道：在斷奶后的第4天，斷奶仔豬單次口服表達F4ac的弱毒大腸桿菌后，在第7天不能抵抗強毒力菌株的感染[6]。一種名為Coliprotec的口服活疫苗今年來相繼在加拿大、巴西、美國等地開始應用，這種疫苗可抵抗F4陽性ETEC引起的腹瀉。這種疫苗含有天然無致病力的大腸桿菌，表達F4粘附素但不產(chǎn)生毒素。臨床實驗證明Coliprotec能很好的抵抗致病性F4陽性ETEC的感染且安全性好。F4陽性ETEC引起的斷奶后腹瀉（PDW）一般發(fā)生在斷奶后3～10天，因此，從斷奶第1天至發(fā)生有一個時間間隔無法得到保護。為了避免這種情況，第一次接種最好在哺乳期，但在這個階段胃腸道存在的哺乳期抗體也許會影響疫苗株的繁殖甚至免疫失敗。雖然Bertschinger等人在試驗中用F18ac陽性大腸桿菌疫苗免疫哺乳仔豬（由帶有F18特異性初乳IgA抗體的母豬所產(chǎn)）取得了好的效果，但對F18ab沒有起到交叉保護[2]。另外，在Coddens等人的研究中發(fā)現(xiàn)，日齡10天的仔豬中不表達或弱表達F18受體，在這些豬腸道中不太可能有細菌的繁殖[7]。因此，對這種疫苗的保護作用需進一步研究。

3 膠囊亞單位活疫苗的應用

為了提高活疫苗和亞單位疫苗的效果，膠囊疫苗的應用起到了較好的作用。在哺乳期間，膠囊疫苗可以保護疫苗在胃腸道運輸過程中被母源抗體和其他的乳汁因子（如乳脂球上的受體類似物或乳清等）中和掉。Felder等人檢測了微型膠囊疫苗的效果，他們將F18陽性大腸桿菌和F18菌毛裝在聚丙交酯-乙交酯(PIgA)微球中，通過噴霧干燥和口服的方法免疫新生仔豬和斷奶仔豬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：口服F18菌毛膠囊疫苗沒有明顯提高斷奶仔豬的血清抗體應答，也不能減少大腸桿菌感染細菌的繁殖，Verdonckde等人研究中也得到了類似的結(jié)果[2,5,8]。雖然給哺乳仔豬口服F18陽性大腸桿菌疫苗能取得較好的效果，但膠囊化的F18陽性大腸桿菌在斷奶仔豬和哺乳期仔豬都未能顯著誘導應答。

膠囊化的F4菌毛能顯著減少攻毒后F4陽性ETEC的分泌，但當給哺乳仔豬口服接種F4菌毛培養(yǎng)液時不能取得這樣的效果，這表明膠囊化對保護抗原免受胃和小腸前段中酶的降解和失活或受乳汁因子中和有積極作用的，但需進一步優(yōu)化以提高其作用。一種由高直鏈淀粉羥甲基淀粉組成的口服片劑可以用來傳送F4陽性大腸桿菌或純化的F4菌毛，可以使細菌有更高的成活率并使F4菌毛在胃腸道中更穩(wěn)定。抗原的釋放處決于片劑從酸性的胃內(nèi)環(huán)境到堿性酶的腸道環(huán)境過程中的快速膨脹，觸發(fā)快速的溶解。分裝在Gantrez納米中的F4膠囊雖然能提高抗F4血清抗體水平，但與溶解的F4菌毛相比不能提高血清抗體應答[9]。

4 注射疫苗的應用

由于乳汁母源抗體的存在，可以用注射用免疫對哺乳仔豬進行疫苗。這些疫苗通常只刺激系統(tǒng)免疫而不作用于粘膜免疫系統(tǒng)。在哺乳期間，肌肉注射福爾馬林滅活的F4陽性大腸桿菌可導致免疫抑制。經(jīng)肌肉免疫1mg F4菌毛能誘導系統(tǒng)IgA應答。當疫苗劑量降到0.1mg時，引起的應答反應更強，這提示除免疫途徑外，抗原劑量在誘導血清IgA應答中也起著很重要的作用。此外，用小規(guī)模無菌豬進行試驗發(fā)現(xiàn)，肌肉注射融合蛋白FaeG-FedF-LT192A2:B可誘導血清、糞便和腸道沖洗物中IgA抗體的產(chǎn)生，這樣可以中和CT，抑制F4和F8的粘附而保護豬只。融合蛋白的使用可以用來研發(fā)多價苗來抵抗ETEC誘導的斷奶后仔豬腹瀉。維生素D3作為免疫調(diào)節(jié)因子，可以用來調(diào)節(jié)系統(tǒng)對腸粘膜IgA的應答。聯(lián)合肌肉注射維生素D3和抗原可使派爾集結(jié)淋巴結(jié)中IgA ASC數(shù)量的增加。在第8天和第25天時用F4菌毛肌內(nèi)免疫哺乳仔豬，在第33天攻毒后能減少糞便排泄物，當維生素D3增加時這種作用更明顯[10]。

5 結(jié)語

ETEC一直是引起斷奶仔豬腹瀉的重要原因，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中導致嚴重的經(jīng)濟損失，其致病與F4或F8密切相關。當感染時，在小腸中特異的F4和F8 sIgA應答可防止細菌增殖。目前，幾個口服疫苗包括亞單位苗和口服活苗在斷奶仔豬中取得了較好的效果。由于F4陽性ETEC引起仔豬腹瀉一般發(fā)生在斷奶后的3～10天，因此在哺乳期間免疫更理想。膠囊化的亞甲基苗和口服活疫苗可以克服疫苗在胃腸道中被降解，還可防止被母源抗體和/或其他乳汁因子中和，但目前應用效果不佳。用注射用疫苗是另外一種可行的預防途徑，但用于母豬的注射用疫苗傾向于刺激全身的而不是局部粘膜免疫系統(tǒng)。雖然注射免疫后可誘導系統(tǒng)的IgA應答和腸道IgA抗體產(chǎn)生，但在ETEC感染時，有效的ETEC免疫通常也需要GALT中特異性抗體IgA ASC的存在。維生素D3作為一種免疫調(diào)節(jié)因子在小鼠中取得了好的效果，但當應用于哺乳仔豬時并沒有獲得保護性的粘膜免疫。因此，在注射免疫中，膠囊化的活疫苗和免疫調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合使用可以克服哺乳期注射疫苗帶來的問題，但仍需進一步的研究?！?/p>

[1]Jeyasingham MD,Butly P,King TP,Begbie R,Kelly D:Escherichia coli K88 receptor expression in intestine of disease-susceptible weaned pigs [J].Veterinary Microbiology,1999,68(3-4):219-234.

[2]Melkebeek V,Goddeeris BM,Cox E:ETEC vaccination in pigs[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2013,152(1-2):37-42.

[3]Fairbrother JM,Nadeau E,Gyles CL:Escherichia coli in postweaning diarrhea in pigs:an update on bacterial types,pathogenesis,and prevention strategies[J].Animal Health Research Reviews,2005,6(1):17-39.

[4]Joensuu JJ,Verdonck F,Ehrstrm A,Peltola M,Siljander-Rasi H,Nuutila AM,Oksman-Caldentey KM,Teeri TH,Cox E,Goddeeris BM,Niklander-Teeri V.F4(K88)fimbrial adhesin FaeG expressed in alfalfa reduces F4+enterotoxigenic Escherichia coli excretion in weaned piglets[J].Vaccine,2006,24(13):2387-2394.

[5]Verdonck F,Tiels P,van Gog K,Goddeeris BM,Lycke N,Clements J,Cox E:Mucosal immunization of piglets with purified F18 fimbriae does not protect against F18+Escherichia coli infection[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2007,120(3-4):69-79.

[6]Bozi F,Lackovi G,Stokes CR,Valpoti I:Recruitment of intestinal CD45RA+and CD45RC+cells induced by a candidate oral vaccine against porcine post-weaning colibacillosis[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2002,86(3-4):137-146.

[7]Coddens A,Verdonck F,Mulinge M,Goyvaerts E,Miry C,Goddeeris B,Duchateau L,Cox E:The possibility of positive selection for both F18(+)Escherichia coli and stress resistant pigs opens new perspectives for pig breeding[J].Veterinary Microbiology,2008,126(1-3):210-215.

[8]Felder CB,Vorlaender N,Gander B,Merkle HP,Bertschinger HU:Microencapsulated enterotoxigenic Escherichia coli and detached fimbriae for peroral vaccination of pigs[J].Vaccine,2000,19(7-8):706-715.

[9]CalinescuC,Nadeau E,Mulhbacher J,Fairbrother JM,Mateescu MA:Carboxymethyl high amylose starch for F4 fimbriae gastro-resistant oral formulation[J].International Journal of Pharmaceutics,2007,343(1-2):18-25.

[10]Van der Stede Y,Cox E,Verdonck F,Vancaeneghem S,Goddeeris BM:Reduced faecal excretion of F4+-E coli by the intramuscular immunisation of suckling piglets by the addition of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 or CpG-oligodeoxynucleotides[J].Vaccine,2003,21(9-10):1023-1032.

S858.28

A

1006-4907（2014）03-0001-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2014.03.001

楊佳亮(1990～），女，在讀碩士，主要從事重大疫病防控工作，E-mail∶YJL900521@126.com?！?通訊作者：楊青，qingyanghn@hunau.edu.cn。

2014-03-15