張衛(wèi)紅 彭安堂

(河北省石家莊市中醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050051)

生物轉(zhuǎn)化中藥的研究思路淺論

張衛(wèi)紅 彭安堂1

(河北省石家莊市中醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050051)

中藥；生物轉(zhuǎn)化；研究思路

隨著中醫(yī)藥事業(yè)的不斷發(fā)展，中醫(yī)藥療效的提升成為人們關(guān)注的焦點。在中藥資源不斷減少，療效不斷降低的今天，生物工程技術(shù)應(yīng)用于中藥領(lǐng)域，將成為未來擴大中藥資源、提高中藥療效的有力手段。但是，目前中藥生物工程技術(shù)研究的重點還是單味藥及其化學(xué)成分的變化等方面，復(fù)方的研究還處于探討階段。我們通過總結(jié)整理中醫(yī)藥生物工程技術(shù)的研究現(xiàn)狀，提出以中醫(yī)藥整體觀念研究中藥復(fù)方發(fā)酵的思路及方法，為這項研究提供一些思路。

1 中醫(yī)藥生物工程技術(shù)研究現(xiàn)狀

生物技術(shù)包括細(xì)胞工程、發(fā)酵工程、酶和蛋白質(zhì)工程、基因工程共4個方面?，F(xiàn)代中醫(yī)藥生物工程技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了二三十年，取得了很多研究成果，主要包括以下2個方面。

1.1 單味中藥的化學(xué)成分變化研究 目前大多數(shù)中醫(yī)藥生物技術(shù)研究都集中到了中藥化學(xué)成分變化方面。按化學(xué)反應(yīng)類型概括起來主要有[1]：①羥基化反應(yīng)，烯丙位C=C雙鍵的羥基化反應(yīng)區(qū)域選擇性和立體選擇性較強；②糖基化反應(yīng)，主要有2種：一是羧酸和糖片段之間發(fā)生酯化反應(yīng)，一是羥基和糖片段之間發(fā)生糖基化反應(yīng)；③氧化還原反應(yīng)，包括醇與酮之間的轉(zhuǎn)化、羰基的還原、環(huán)氧化作用及C=C雙鍵的還原等。按研究的生物轉(zhuǎn)化化學(xué)成分類別主要有：蟾蜍甾烯類的蟾毒；萜類化合物的紫杉醇、斑蝥素、青蒿素、木香烯內(nèi)酯類及雷公藤二萜類等；生物堿類的左旋四氫巴馬汀、吳茱萸堿、麻黃堿及野罌粟堿；苷類的天麻素、人參皂苷、七葉皂苷、熊果苷、甘草酸苷等；醌類的大黃素；黃酮類的柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷及木犀草素等[2-3]。

1.2 菌種選育研究 很多學(xué)者從不同的中藥品種角度或從不同的微生物菌種角度做了很多研究。研究紅曲的過程中開發(fā)了新藥洛伐他汀[4]；吳虹麗等[5]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉、米曲霉、黑曲霉、黑根霉、桔青霉及辣椒炭疽菌6種真菌具有轉(zhuǎn)化龍膽苦苷的能力。在人參生物轉(zhuǎn)化研究中，很多學(xué)者研究了不同的菌種如：Dong等[6]研究了黑曲霉菌(aspergillus niger)和藍(lán)色梨頭霉(absidia coeruleavar.saccardoi)；崔宇等[7]研究了鐮刀霉屬霉菌(fusarium spp.)；Chi H等[8]研究了德氏乳桿菌(lactobacillus)和雙歧桿菌(bifidobacteria)；韓穎等[9-10]研究了甘蔗鐮孢(fusarium sacchari)；吳秀麗等[11]研究了疣孢漆斑菌(myrothecium verrucaria)；昆明諾唯金參生物工程有限責(zé)任公司[12]研究了弗氏鏈霉菌(streptomyces fradiae)；趙鵬[13]研究了哈茨木霉(trichoderma harzianum)；浙江大學(xué)發(fā)表專利研究了芽孢桿菌(bacillu)[14]；云南大學(xué)發(fā)表專利研究了米曲霉[15]；趙鵬等[16]研究了木霉屬4株、曲霉屬1株、節(jié)叢孢屬1株；韓穎等[17]研究了鐮刀霉屬霉菌(fusarium spp.)。關(guān)于菌種方面的研究方興未艾，很有研究價值。關(guān)于單味藥的化學(xué)成分變化研究成果很多，主要集中在提高提取率、提高有效成分含量、提高利用度、降低毒副作用等方面，在此不再贅述。

2 目前生物轉(zhuǎn)化研究存在的問題

目前，生物轉(zhuǎn)化還存在很多值得探討的問題。首先是菌種選育成功率較低，生物轉(zhuǎn)化可選用菌種雖然很多，酶系廣，但從中選出合適的菌種并不容易。菌種選育、誘變育種及基因工程育種是一項非常龐大的工程，選育菌株帶有很大的偶然性，想選育出一株選擇性強的適合特定反應(yīng)的菌株，工作量很大，成功率很低。即使選出了特定菌株，其產(chǎn)率往往也很低，雖然優(yōu)化培養(yǎng)條件可使產(chǎn)率提高，但是顯著提高產(chǎn)率并不容易。非常典型的例子是青霉素的發(fā)酵，經(jīng)過幾代人的努力，不斷地選育菌種、優(yōu)化發(fā)酵工藝，才達(dá)到現(xiàn)在的生產(chǎn)水平。其次是中藥生物轉(zhuǎn)化大部分還停留在實驗室研究階段，雖然個別品種進(jìn)入了臨床階段，但生物轉(zhuǎn)化中藥對臨床的影響力較小，進(jìn)一步開發(fā)及臨床應(yīng)用還有很長的路要走。第三是從事中醫(yī)藥生物轉(zhuǎn)化工作的大多數(shù)是藥學(xué)人員，缺少中醫(yī)臨床醫(yī)師的參與，目前的研究基本上都停留在單味藥的研究上，中醫(yī)藥在應(yīng)用的時候大部分都是復(fù)方，目前對復(fù)方的研究很少，距離臨床應(yīng)用就更遠(yuǎn)了。因此，中醫(yī)藥生物工程技術(shù)研究目前最大的問題是其與中醫(yī)藥理論和臨床應(yīng)用的脫節(jié)。

3 中醫(yī)藥生物工程技術(shù)研究的思路探討

3.1 以療效為準(zhǔn)繩評價生物轉(zhuǎn)化中藥 中醫(yī)藥概念的核心在于以“中醫(yī)藥理論體系”為指導(dǎo)，以整體觀念為主體的中醫(yī)理、法、方、藥學(xué)術(shù)理論體系與中醫(yī)臨床實踐的統(tǒng)一。以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，研究經(jīng)過生物工程技術(shù)加工后的單味中藥或復(fù)方的功效、藥性、歸經(jīng)、配伍、炮制、毒性、體內(nèi)過程，以觀其藥效并研究其作用機制。這一從實踐到理論的分析方法貫穿了中醫(yī)的發(fā)展過程。中醫(yī)藥理論是綱，臨床應(yīng)用是目的，生物工程技術(shù)是方法和手段，不能脫離了中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)而孤立地搞中醫(yī)藥生物工程技術(shù)。在機制短時期內(nèi)無法搞清的情況下，還應(yīng)以療效為準(zhǔn)繩評價生物轉(zhuǎn)化中藥。

3.2 基于中醫(yī)整體觀念提出的生物轉(zhuǎn)化中藥的研究思路 我們建議以全成分復(fù)方研究及藥理模型作為主要研究思路。研究流程如下：第1階段以中醫(yī)藥理論及臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)確定研究品種；第2階段中醫(yī)藥生物工程技術(shù)處理；第3階段藥理模型篩選、急毒長毒等動物實驗；第4階段轉(zhuǎn)化物或其提取物應(yīng)用于醫(yī)藥實踐研究及中醫(yī)藥理論評價；第5階段轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化、化學(xué)成分變化研究及轉(zhuǎn)化酶性質(zhì)研究。

3.2.1 確定哪些中藥或復(fù)方適合應(yīng)用生物工程技術(shù)需要結(jié)合中醫(yī)藥理論和臨床應(yīng)用。臨床應(yīng)用是出發(fā)點也是歸宿，臨床上應(yīng)用的多是復(fù)方，藥物療效是多成分多靶點共同作用的結(jié)果。以中醫(yī)整體觀念看待中藥復(fù)方，選擇療效確切的復(fù)方進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化研究，以療效為標(biāo)準(zhǔn)來考究生物技術(shù)應(yīng)用的最終結(jié)果。故提出中醫(yī)藥生物工程技術(shù)的研究應(yīng)該以復(fù)方為主，單味藥為基礎(chǔ)。

3.2.2 建立中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下融合現(xiàn)代藥理學(xué)、生理學(xué)方法的快速、高效、廉價的藥物篩選模型是中醫(yī)藥生物工程技術(shù)能否成功的重要因素。中醫(yī)的“病”和“證”是與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“疾病”和“癥狀”不同的概念。中藥所用藥理模型主要有3類：中藥藥理疾病動物模型、中藥藥理證候動物模型、中藥藥理病證動物模型。疾病動物模型借鑒西方醫(yī)學(xué)中的方法比較成熟，可用模型多，造模方法穩(wěn)定，實驗結(jié)果可靠，重復(fù)性好，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究結(jié)果有可比性。同時也必須提到高通量篩選，現(xiàn)在已經(jīng)進(jìn)入后基因組時代，基于靶點的高通量篩選已經(jīng)成為藥物開發(fā)計劃中重要的一個部分。隨著組合化學(xué)、基因組學(xué)及蛋白組學(xué)的飛速發(fā)展，一方面功能基因組計劃有助于快速地確定一些特定路徑中的蛋白—蛋白相互作用，另一方面各種高通量的篩選系統(tǒng)能夠針對特定靶點進(jìn)行高效快速的化合物分子庫篩選。中藥的篩選模型也可以借助高通量篩選的途徑。中藥復(fù)方的生物工程技術(shù)目前報道研究得非常少，以下是幾例比較系統(tǒng)的報道：陳冰等[18-19]研究發(fā)現(xiàn)桂枝湯及其生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物對白細(xì)胞介素(IL)-1β刺激小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3)合成細(xì)胞前列腺素的代謝酶系統(tǒng)有不同程度的抑制作用，從而降低了前炎癥介質(zhì)和中樞發(fā)熱介質(zhì)PGE2的釋放和分泌。王月飛等[20]、王玉閣等[21]研究了米曲霉(AS3.951)對玉屏風(fēng)散的生物轉(zhuǎn)化，并研究了其轉(zhuǎn)化液一系列的生理作用，如提高免疫抑制小鼠的體液免疫功能；對正常小鼠抗氧化功能及免疫抑制小鼠T細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子IL-4和細(xì)胞因子γ-干擾素(IFN-γ)的影響；對免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫的干預(yù)作用；對免疫抑制小鼠血清IL-2的影響等。發(fā)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化的玉屏風(fēng)散生物轉(zhuǎn)化液比玉屏風(fēng)散煎劑更能提高免疫抑制小鼠的體液免疫功能。在中醫(yī)藥理論和臨床應(yīng)用的指導(dǎo)下選擇臨床上需要、理論上可行、技術(shù)上可操作的品種進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的研究，楊秀偉等[22]建立了人腸內(nèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)化中藥化學(xué)成分的模型和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，用于研究和評價中藥化學(xué)成分在腸內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化。將原形化合物與其建立的中藥化學(xué)成分腸吸收細(xì)胞模型人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系(human colon adenocarcinoma cell line，Caco-2)串聯(lián)，能夠探討真正吸收進(jìn)入體循環(huán)的化學(xué)實體和它們在腸吸收過程中的相互作用，并串聯(lián)肝臟藥物代謝酶細(xì)胞色素P450模型，使中藥化學(xué)成分體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化和(或)代謝研究一體化。

以上各項研究通俗地講就是應(yīng)用中藥藥理疾病模型，以藥理作用、動物實驗療效觀察為主線的研究。有藥理作用的生物轉(zhuǎn)化中藥就需要用中醫(yī)藥理論進(jìn)一步解釋這種作用。轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化、化學(xué)成分變化研究及轉(zhuǎn)化酶性質(zhì)研究，都是希望進(jìn)一步揭示其作用機制。這就是實踐到理論的研究方法，同時是在中醫(yī)藥理論基礎(chǔ)上的創(chuàng)新，尊古不泥古，創(chuàng)新不唯新，醫(yī)學(xué)可以分中醫(yī)、西醫(yī)，可以分不同的學(xué)術(shù)流派，可以有大相徑庭的治療方法和理論解釋，但是所有醫(yī)藥學(xué)的宗旨都是一致的，為了人類身心健康，所有醫(yī)藥學(xué)的對象都是相通的，以疾病為主體，所有醫(yī)藥學(xué)的評價標(biāo)準(zhǔn)都是一致的，即治療效果好。目前歐美西方醫(yī)學(xué)大行其道，不但在西方而且在全球都處于絕對領(lǐng)先的地位，因為其理論和療效清晰、準(zhǔn)確。而中醫(yī)、印度傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)、泰國醫(yī)學(xué)等國家本土醫(yī)學(xué)在本國也處于非主流地位，原因比較復(fù)雜，其深層次原因是理論和實踐創(chuàng)新不夠，沒能跟上時代科學(xué)技術(shù)的步伐，沒能將現(xiàn)代科技的發(fā)展成果吸收進(jìn)來。中醫(yī)藥理論也應(yīng)該深入到分子水平，細(xì)微化到微米、納米級別，也可以將循證醫(yī)學(xué)的思路、方法吸收到中醫(yī)藥理論中來，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院前院長Charles Sidney Burwell曾說過：在10年內(nèi)，作為醫(yī)學(xué)生你們學(xué)到的一半知識都會被證明是錯誤的，而且麻煩的是沒有老師能夠告訴你們哪一半是錯誤的。西方醫(yī)學(xué)能發(fā)展得如此之快，與其開放的學(xué)風(fēng)，兼收并蓄的理念不無關(guān)系。

3.2.3 最后一個階段為研究化學(xué)成分變化，酶的性質(zhì)及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化。為了更加準(zhǔn)確地從藥學(xué)的角度研究其作用機制及上升到理論高度。這也是目前生物轉(zhuǎn)化研究較多的方面。化學(xué)成分變化的研究隨著分離技術(shù)的日益成熟，人們已經(jīng)從中藥中分離純化出數(shù)以萬計的活性化合物，其中許多化合物被成功地開發(fā)成為藥物，諸如利血平、地高辛、青蒿素、麻黃堿、紫杉醇等。研究方法采用天然藥物化學(xué)的研究方法如：層析技術(shù)、吸附技術(shù)、離子交換技術(shù)、溶媒萃取技術(shù)、色譜分析制備、紅外線、紫外線等光譜分析、X-衍射、質(zhì)譜、核磁等技術(shù)，尤其是核磁中的氫譜、碳譜、二維譜的應(yīng)用使結(jié)構(gòu)分析越來越清晰。生物轉(zhuǎn)化方法主要包括：分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法；靜止細(xì)胞轉(zhuǎn)化法；應(yīng)用微生物孢子進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化法，此方法空白背景干擾小，生物轉(zhuǎn)化活力較高；應(yīng)用固定化細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化法，此方法可以反復(fù)使用，具有產(chǎn)物提取簡單，便于自動化和大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢；應(yīng)用滲透細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化法，此方法適合于胞內(nèi)酶作用的生物轉(zhuǎn)化；利用酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化法，此方法具有專一性強的特點。生物轉(zhuǎn)化本質(zhì)上是一個酶促反應(yīng)，它受到諸多因素的制約，如轉(zhuǎn)化時間、溫度、底物添加方式、酶的誘導(dǎo)劑、抑制劑以及生長調(diào)節(jié)劑的加入都對轉(zhuǎn)化有一定的影響[2]。這就需要采用正交實驗等方法優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件。對生物酶的研究多采用生物基因技術(shù)的方法如：透析、超濾、柱層析、電泳、克隆、表達(dá)等，并發(fā)現(xiàn)了許多優(yōu)良的新酶，這些酶大多具有可以催化一系列的底物，并且擁有區(qū)域選擇性或立體選擇性的催化特性。在酶催化的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中如酯酶、蛋白酶、脂肪酶等水解酶[23]。硫酸酯酶可以立體選擇性和對映體選擇性地催化水解仲烷基硫酸酯，并通過改變其構(gòu)象從而產(chǎn)生純手性的化合物[24]。鹵代醇脫鹵酶可以催化多種非天然親核性底物[25]。在水介質(zhì)中，裂解酶可以催化偶姻或苯偶姻反應(yīng)從而產(chǎn)生非對稱的碳-碳鍵[26]。還有可用酶催化手性化合物的方法，消旋體的方法等。

小結(jié)以中醫(yī)整體觀念的思想研究生物轉(zhuǎn)化的中藥，使之更加緊密地與臨床相結(jié)合，利于有的放矢地開展研究。采用從臨床到實驗室，與現(xiàn)代制藥技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)一步觀察新產(chǎn)品的療效，從而回到臨床，根據(jù)療效探究其生物轉(zhuǎn)化中藥的機制。提倡將現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)發(fā)展的新思路、新技術(shù)引入中醫(yī)藥發(fā)展領(lǐng)域，提倡對實驗事實的尊重與對傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論的傳承與創(chuàng)新。

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(本文編輯：李珊珊)

張衛(wèi)紅(1963—)，女，副主任中藥師，學(xué)士。研究方向：中藥鑒別、中藥房的管理。

R28；R9-13

A

1002-2619(2014)11-1745-03

2013-11-14)

1 河北省石家莊市中醫(yī)院制劑室，河北 石家莊 050051