李 凱，田淑芬

（天津市農(nóng)科院葡萄研究中心，天津 300192）

蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，簡(jiǎn)稱MLF）是葡萄酒釀造中非常重要的二次發(fā)酵過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，只有部分乳酸菌（LAB）可進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵。它們分屬于酒球菌屬（Oenococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）[1]。國(guó)內(nèi)外研究表明，能夠適應(yīng)葡萄酒環(huán)境、較專一地進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵并對(duì)酒質(zhì)有增益作用的乳酸菌主要是酒酒球菌[2]，因此乳酸菌種類鑒定對(duì)于優(yōu)良發(fā)酵特性菌株的篩選具有非常重要的意義。

乳酸菌分類鑒定方法可分為傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)分類鑒定方法主要是借助菌株間的表型性狀，但常煩瑣而耗時(shí)，且鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確。分子生物學(xué)的快速發(fā)展及其在細(xì)菌分類鑒定中的應(yīng)用，是細(xì)菌的分類鑒定與菌株區(qū)分方法的一次革命[3]?？茖W(xué)家開(kāi)始從分子和基因水平認(rèn)識(shí)乳酸菌的遺傳結(jié)構(gòu)、組成和分類，同時(shí)許多新的分子標(biāo)記被用于乳酸菌的分類和鑒定，如16S rDNA序列分析、16S～23S rRNA基因間隔區(qū)（Intergenic Spacer Region，ISR）序列分析和基于 PCR技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)等，其中基于 PCR技術(shù)的分子標(biāo)記又可分為擴(kuò)增rDNA限制性酶切片段分析（Amplified RibosomalD NA Restriction Analysis，ARDRA）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 （Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）等[4]。

1 16S rDNA/rRNA序列分析

16S rDNA/rRNA序列同源性分析是指用特定引物對(duì)供試菌株保守序列16S rDNA/rRNA進(jìn)行特異擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知序列進(jìn)行BLAST分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的菌株的鑒定。DU PLESSIS等綜合運(yùn)用16S rRNA序列分析和種內(nèi)特異性引物PCR來(lái)鑒定葡萄汁和白蘭地生產(chǎn)過(guò)程中分離出的54個(gè)菌株，其中大多數(shù)是酒酒球菌（22株），但也分離出少量短乳桿菌（8株）、益生菌（8株）和植物乳桿菌（6株）[5]。Koh等（2004）通過(guò)局部16S rDNA排序和系統(tǒng)進(jìn)化分析來(lái)進(jìn)行菌類鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化分析中，戊糖乳桿菌和植物乳桿菌16S rDNA有99.7% 的相似性[6]。Narvaez-Zapata，J.A等利用變性梯度凝膠電泳（DGGE）來(lái)分析16S rRNA基因，他們發(fā)現(xiàn)龍舌蘭酒中的乳酸菌群落主要由小片球菌、短乳桿菌、類布氏乳桿菌和植物乳桿菌組成，另外還在殘汁中發(fā)現(xiàn)了魏斯氏菌屬和芽孢桿菌屬這些非典型的屬[7]。16S rDNA/rRNA序列保守且鑒定結(jié)果的可靠，是目前細(xì)菌分類和鑒定經(jīng)常使用的一種檢測(cè)方法，但該方法通常進(jìn)行乳酸菌菌種間的鑒定，對(duì)于高同源性的乳酸菌菌株之間分辨率不高，而且該方法費(fèi)時(shí)且成本較高，在生產(chǎn)上的推廣受到限制。

2 16S～23S rRNA間隔序列分析

16S～23S rRNA基因（ITS）是 16S rRNA 基因與23S rRNA基因的間隔序列，其進(jìn)化速度是16S rRNA的10倍，具有可重復(fù)性和保守性，此外其16S rRNA端及23S rRNA端高度保守，故成為繼16S rRNA后又一新位點(diǎn)。周利國(guó)等利用16S～23S間隔序列對(duì)4株優(yōu)選菌株進(jìn)行同源性分析，通過(guò)與酒明串珠菌（Leuconostoc oenos）16S～23S間隔序列比對(duì)構(gòu)建聚類圖，結(jié)果顯示4株菌16S～23S間隔序列的同源性為100%，推知這4株菌可能為同一類菌株[8]。該方法不但可用于菌種鑒定，還可以用于分辨16S rRNA不能鑒別的高同源性菌株[9]。

3 基于PCR技術(shù)的DNA分子標(biāo)記

隨著DNA標(biāo)記技術(shù)的不斷成熟，人們建立了一系列以DNA標(biāo)記為基礎(chǔ)的微生物鑒定和檢測(cè)技術(shù)，根據(jù)菌株之間遺傳距離所產(chǎn)生的DNA指紋差異來(lái)直接反映供試菌株DNA多態(tài)性。這些技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)是可以忽略各種復(fù)雜的微生物生長(zhǎng)條件，不需要預(yù)先培養(yǎng)就可鑒定和檢測(cè)。多數(shù)研究結(jié)果表明，DNA標(biāo)記分型技術(shù)具有從種屬到菌株各種水平的鑒別能力，為乳酸菌的快速分子鑒定和分型提供了新方法[10]。

3.1 擴(kuò)增核糖體DNA限制性酶切片段分析（Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis，ARDRA）

ARDRA基于PCR技術(shù)選擇性擴(kuò)增DNA片段，對(duì)所擴(kuò)增片段進(jìn)行限制性酶切，最后分析酶切后所得片段的多態(tài)性。該方法首先提取總DNA，以其作為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的DNA，之后選擇多種有4～6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切，并對(duì)酶切后的DNA片段進(jìn)行聚類分析[11]。

Rodas，AM等先對(duì)16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后用限制性內(nèi)切酶（BfaI或MseI或AluI）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。他們按順序使用3種限制性內(nèi)切酶簡(jiǎn)化乳酸菌鑒定，先是MseI，然后是BfaI，最后若有必要，再用AluI。這種技術(shù)可以區(qū)別出36個(gè)參照乳酸菌種類中的32個(gè)，而且可以對(duì)葡萄汁和葡萄酒中的342個(gè)菌株進(jìn)行鑒定，可鑒定出這些菌株屬于短乳桿菌、丘狀乳桿菌、棒狀乳桿菌、希氏乳桿菌、媚麗乳桿菌（益乳桿菌）、益生菌、腸膜明串珠菌、酒酒球菌、微片球菌和戊糖片球菌[12]。Manes-Lazaro，R等則綜合運(yùn)用16S擴(kuò)增性rDNA限制性片段分析和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)將西班牙博巴爾（Bobal）葡萄酒中10個(gè)乳酸菌菌株與它們的近似種區(qū)別開(kāi)來(lái)[13]。

Marques，AP等發(fā)現(xiàn)距離16S rRNA基因5’末端大概300nt處存在酒酒球菌獨(dú)有的FseI識(shí)別序列（GGCCGGCC）。對(duì)于所有的酒酒球菌菌株，用pA和pH引物擴(kuò)增都能獲得大約1560bp的16S rDNA擴(kuò)增子，且在FseI酶切后都能獲得326和1233bp的兩個(gè)片段。酒酒球菌分子標(biāo)記（326與1233bp片段）的檢測(cè)限要求菌落數(shù)達(dá)到102～103cfu/mL[14]。

劉樹(shù)文和余東亮以實(shí)驗(yàn)室保存的23株酒酒球菌為供試材料，對(duì)擴(kuò)增的16SrDNA特異條帶進(jìn)行了酶切分析。結(jié)果表明，在確立的PCR體系上，均能擴(kuò)增出一條長(zhǎng)約995bp的特異條帶。酶切結(jié)果顯示，HindⅢ和MseⅠ酶切圖譜未顯示出菌株間的差別，表明了菌株間緊密的親緣關(guān)系。AluⅠ的酶切圖譜通過(guò)NT2SYSPC2.1軟件生成UPGMA聚類圖，在0.63水平上可以把23株菌區(qū)分為2個(gè)大類[15]。

ARDRA技術(shù)在葡萄酒乳酸菌鑒定中已經(jīng)得到較好的應(yīng)用，另外從理論上說(shuō)，ARDRA分析中使用的限制性酶的種類越多，所產(chǎn)生帶型越多，最后結(jié)果越準(zhǔn)確，但使用太多酶進(jìn)行ARDRA分析會(huì)加大時(shí)間、人力和經(jīng)費(fèi)投入，因此優(yōu)化限制性內(nèi)切酶的數(shù)量和種類、篩選最佳的限制性內(nèi)切酶組合對(duì)于ARDRA鑒別體系應(yīng)是一個(gè)不斷完善的課題。

3.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）

RAPD的基本原理是以基因組DNA為模板，以單個(gè)人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列（通常為10個(gè)堿基對(duì)）為引物，在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測(cè)多態(tài)性。擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。

RAPD技術(shù)在乳酸菌的鑒定分型中可作為其他技術(shù)的有力補(bǔ)充。Spano，G等便是聯(lián)合RAPD和物種特異性PCR技術(shù)對(duì)紅葡萄酒中植物乳桿菌進(jìn)行種水平的鑒定[16]。Capozzi，V則是先用特定引物進(jìn)行PCR來(lái)鑒定酒酒球菌，然后運(yùn)用多元的RAPD-PCR分析進(jìn)行進(jìn)一步分類。這種多元方法可篩選有良好蘋乳發(fā)酵性能的酒酒球菌[17]。Solieri等用ARDRA和16S rRNA基因序列分析，鑒定出135株乳酸菌的120個(gè)酒酒球菌菌株，并運(yùn)用基于M13的RAPD來(lái)研究酒酒球菌菌落的分子多樣性，并提出篩選新型酒類酒球菌發(fā)酵劑的框架圖[18]。Bartowsky等曾用RAPD對(duì)酒酒球菌的種內(nèi)變種進(jìn)行研究，他們通過(guò)RAPD成功區(qū)分澳大利亞不同產(chǎn)區(qū)15株菌中的10個(gè)，用4個(gè)RAPD引物和它們的基因相似性可鑒別6個(gè)商業(yè)酒酒球菌株，而來(lái)自同一個(gè)酒廠的酒酒球菌菌株則不能被區(qū)別開(kāi)來(lái)。RAPD對(duì)未知來(lái)源的酒酒球菌進(jìn)行分析時(shí)表現(xiàn)出更高靈敏度，從而能夠更好的對(duì)有良好發(fā)酵性能的酒酒球菌進(jìn)行基因分析[19]。Ruiz，P等運(yùn)用RAPD-PCR對(duì)Tempranillo葡萄酒中的微生物群進(jìn)行分類，然后用分子和傳統(tǒng)方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明有一種酒酒球菌基因型在所有酒樣中同時(shí)存在，這種酒酒球菌可能是當(dāng)?shù)靥赜械模铱赡茉谄咸丫漆勗爝^(guò)程中起重要的作用[20]。

RAPD技術(shù)相對(duì)于其它多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)來(lái)說(shuō)方法簡(jiǎn)便易行，可以直接對(duì)生物DNA進(jìn)行多態(tài)性分析，研究所需DNA量極少，其引物沒(méi)有嚴(yán)格的種屬局限。但是RAPD技術(shù)也存在一定局限性，它是一種顯性標(biāo)記，不能有效區(qū)分雜合子，穩(wěn)定性差，可重復(fù)性小，對(duì)反應(yīng)條件變化十分敏感。Taq聚合酶的來(lái)源、DNA的不同提取方法、PCR儀的不同型號(hào)都會(huì)影響檢測(cè)的結(jié)果。因此，在RAPD研究中需要嚴(yán)格控制DNA模板的質(zhì)量和擴(kuò)增反應(yīng)條件。

3.3 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism）

RFLP是1986年由Pedersen等人發(fā)明的一項(xiàng)分子標(biāo)記技術(shù)。限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的特異核苷酸序列，并且在特異位點(diǎn)切割DNA分子，產(chǎn)生一系列大小各異，長(zhǎng)短不一的DNA限制性片斷。由于不同的種，菌株等個(gè)體中的DNA核苷酸序列既同源又存在遺傳變異性，所以經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶的酶切消化，同源DNA限制片斷在不同來(lái)源個(gè)體中的長(zhǎng)度可能有所變異，這種變異就稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。RFLP是可以用于種內(nèi)水平鑒定乳酸菌分離株的一種DNA指紋方法。Claisse，O等（2007）運(yùn)用PCR-RFLP分析rpoB基因序列從而鑒定分離自葡萄酒的乳酸菌種類。先通過(guò)固體培養(yǎng)基和顯微鏡觀察來(lái)區(qū)別球菌和桿細(xì)胞，之后用AciI對(duì)球菌進(jìn)行單一的酶切消化，同時(shí)用AciI，HinfI和MseI對(duì)桿菌進(jìn)行2個(gè)或3個(gè)酶切消化，7個(gè)球菌菌株和12個(gè)乳酸桿菌便被準(zhǔn)確鑒定[21]。

RFLP也存在一定缺點(diǎn)，如要大量高純度DNA、步驟煩瑣、探針不易制備、周期長(zhǎng)、只能檢測(cè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上的變異等，但是該方法可在種內(nèi)水平鑒定乳酸菌菌株的DNA指紋方法，而且特別適用于構(gòu)建遺傳連鎖圖，在分析種群內(nèi)和種群間的遺傳差異時(shí)非常有用。

3.4 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism）

AFLP的基本原理是對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，用特殊的接頭連接DNA片斷的兩端形成特異片斷，接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)。利用PCR以及PAGE技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增和分離鑒定。AFLP比RAPD和RFLP技術(shù)有更大的優(yōu)越性，主要用于流行病學(xué)及食品源性病原體毒力指標(biāo)的測(cè)定研究（如李斯特桿菌和沙門菌），也可利用該技術(shù)對(duì)種族遺傳關(guān)系密切的菌種（戊糖乳桿菌、植物乳桿菌和類植物乳桿菌）進(jìn)行種水平的鑒定[22]。金剛利用帶有一個(gè)選擇性堿基的四條引物對(duì)酒酒球菌基因進(jìn)行單限制性酶切擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（SE-AFLP）分析，該方法可將22株酒酒球菌完全區(qū)分開(kāi)，因此SE-AFLP分子標(biāo)記技術(shù)可用于酒酒球菌菌株區(qū)分[23]。AFLP具有多態(tài)性豐富，共顯性表達(dá)，不受環(huán)境影響，無(wú)復(fù)等位效應(yīng)，帶紋豐富，用樣量少，靈敏度高，快速高效等優(yōu)點(diǎn)，已成為實(shí)驗(yàn)室鑒定酒酒球菌的常規(guī)方法。

3.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCRDGGE）

PCR-DGGE是基于不同堿基序列的DNA雙鏈解鏈時(shí)需要不同的變性劑濃度的原理，DNA雙鏈一旦解鏈，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度會(huì)急劇下降，因此將PCR擴(kuò)增得到的等長(zhǎng)DNA片段加入到含有變性劑梯度的凝膠中進(jìn)行電泳，序列不同的DNA片段就會(huì)在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化，導(dǎo)致電泳速度的下降，停留在與其相應(yīng)的不同變性劑梯度位置，染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)不同的條帶。Giusto，C等先對(duì)16S rDNA基因V1區(qū)域的DNA片段PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行DGGE來(lái)鑒定葡萄酒生產(chǎn)中常用活性干酵母中的乳酸菌，他們鑒定出活性干酵母中的乳酸菌主要是乳酸桿菌和片球菌[24]。Ruiz，P等通過(guò) PCR-DGGE鑒定出Tempranillo葡萄酒蘋乳發(fā)酵時(shí)的菌落群體包括氧化葡糖桿菌、沙雷氏菌屬、腸桿菌屬的菌株以及酒酒球菌，酒酒球菌是葡萄酒蘋乳發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌種[25]。

PCR-DGGE技術(shù)可以鑒定蘋果酸乳酸發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的種群差異，另外該技術(shù)在分析微生物的遺傳多樣性方面也有明顯的優(yōu)勢(shì)，但是DGGE技術(shù)一般只能分析小于500個(gè)堿基對(duì)的DNA片斷，得到相關(guān)信息少，試驗(yàn)過(guò)程中又常出現(xiàn)共遷移條帶，因此在分析鑒定乳酸菌時(shí)存在較大困難。鑒于此，對(duì)于復(fù)雜菌落，在進(jìn)行鑒定工作時(shí)可以先通過(guò)一些方法降低其分析的復(fù)雜度。比如先根據(jù)不同的GC含量，將基因組總DNA分成各個(gè)部分，再分別進(jìn)行PCR-DGGE分析[26]，從而降低分析微生物多樣性時(shí)復(fù)雜度。

4 種屬特異性PCR鑒定（species-specificPCR）

Zapparoli，G等設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增酒類酒球菌編碼蘋果酸乳酸酶（Malolactic enzyme，MLE）基因的特異性序列，共 1025bp，并用電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，這種方法就是種屬特異性PCR（species-specific PCR）鑒定[27]。

劉延琳等以O(shè)enococcusoeni蘋果酸-乳酸酶基因（mleA）為目標(biāo)基因，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物PmleaL/PmleaR，直接以O(shè)enococcus oeni的菌落為模板，通過(guò)引物對(duì)PmleaL/PmleaR的PCR擴(kuò)增，可得到mleA基因的特異性條帶；用此特異性引物進(jìn)行供試乳酸菌的PCR鑒定，所有Oenococcus oeni菌系均得到特異性條帶，而供試的其它種類乳酸菌未擴(kuò)增出目標(biāo)帶[28]。PmleaL/PmleaR可用于Oenococcus oeni的快速PCR鑒定。Cappello，MS等聯(lián)合 species-specific PCR和 16S rRNA序列分析，在220株乳酸菌中鑒定出87株為酒酒球菌[29]。王華等采用species-specific PCR對(duì)酒酒球菌進(jìn)行鑒定，嘗試通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，直接使用菌液和菌落作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。在優(yōu)化后的反應(yīng)體系下，可直接使用菌液或菌落作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，條帶清晰[30]。種屬特異性鑒定方法快速可靠，節(jié)約成本，可被廣泛應(yīng)用于酒類酒球菌的鑒定。

5 熒光原位雜交法（FISH）

熒光原位雜交法（FISH）是采用免疫熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針與目標(biāo)檢測(cè)物進(jìn)行原位雜交，計(jì)算雜交率來(lái)定量檢測(cè)和鑒定細(xì)菌。Blasco，L等提出了一種基于FISH快速鑒定乳酸菌的方法，運(yùn)用于葡萄酒中常見(jiàn)乳酸菌16S rDNA同源的熒光寡核苷酸探針進(jìn)行鑒定。該方案在36個(gè)參照菌株的雜交的基礎(chǔ)上對(duì)乳酸菌進(jìn)行特定檢測(cè)，探針的專一性可用純培養(yǎng)進(jìn)行評(píng)估。探針可鑒定不同葡萄酒中的乳酸菌種類，這使得對(duì)不經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的自然樣本進(jìn)行直接的鑒定和量化成為可能[31]。

熒光原位雜交法在乳酸菌快速鑒定中有廣闊的發(fā)展前景，在4～16h便可以得出比較準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。FISH可優(yōu)先檢測(cè)數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌。與PCR方法相比，它不需要選擇性純化或擴(kuò)增，可提供一個(gè)更詳細(xì)的微生物圖譜。

6 序列特異性擴(kuò)增區(qū)（Sequence—characterized Amplified Region，SCAR）

SCAR標(biāo)記是將目標(biāo)RAPD片段進(jìn)行克隆并對(duì)其末端測(cè)序，根據(jù)RAPD片段兩端序列設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)基因DNA片段進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，把與原RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒別出來(lái)。Solieri，L和 Giudici，P使用SCAR方法鑒定蘋乳發(fā)酵中的酒酒球菌菌株。試驗(yàn)以酒酒球菌LB221為模板菌株，基于特異性的PAPD片段，在原先的RAPD引物兩端延伸9～13個(gè)堿基設(shè)計(jì)出SCAR標(biāo)記引物，該特異引物可以擴(kuò)增出LB221特有的唯一條帶[32]。

SCAR標(biāo)記是共顯性遺傳，待檢DNA間的差異可直接通過(guò)有無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)顯示。SCAR可以用于酒酒球菌或者是其它乳酸菌的株間鑒定，而且該方法方便、快捷、可靠，可以快速檢測(cè)大量個(gè)體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高，但關(guān)于葡萄酒乳酸菌的SCAR標(biāo)記研究較少，因此SCAR標(biāo)記對(duì)于釀酒乳酸菌的株間鑒定以及對(duì)優(yōu)良性狀連鎖基因的標(biāo)記具有很廣闊的研究空間。

7 脈沖場(chǎng)凝膠電泳

脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一種分離大分子DNA的方法。在普通的凝膠電泳中，大的DNA分子（>10kb）移動(dòng)速度接近，很難分離形成足以區(qū)分的條帶。在脈沖場(chǎng)凝膠電泳中，電場(chǎng)不斷在兩種方向（有一定夾角，而不是相反的兩個(gè)方向）變動(dòng)。DNA分子帶有負(fù)電荷，會(huì)朝正極移動(dòng)。相對(duì)較小的分子在電場(chǎng)轉(zhuǎn)換后可以較快轉(zhuǎn)變移動(dòng)方向，而較大的分子在凝膠中轉(zhuǎn)向較為困難。因此小分子向前移動(dòng)的速度比大分子快。脈沖場(chǎng)凝膠電泳可以用來(lái)分離大小從10kb到10Mb的DNA分子。Lopez等利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)對(duì)植物乳桿菌和酒酒球菌進(jìn)行了基因典型化分析。脈沖場(chǎng)凝膠電泳可以用來(lái)鑒別、檢測(cè)葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中的菌株，對(duì)植物乳桿菌和酒酒球菌菌株的辨識(shí)能力較高[33]。

8 總結(jié)與展望

葡萄釀酒乳酸菌在葡萄酒釀造，特別是干紅葡萄酒釀造中起著重要的作用。乳酸菌表型生化鑒定法耗時(shí)耗力，而且培養(yǎng)和生化鑒定結(jié)果易受到培養(yǎng)條件等諸多因素的影響，且主要缺點(diǎn)在于無(wú)法反應(yīng)菌株的核酸信息。而分子鑒定，特別是基因型鑒定法準(zhǔn)確、快速、靈敏，且分辨率高，已廣泛用于釀酒乳酸菌的分類鑒定。但是由于每種方法基于的原理不同和各種檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)不同，各種方法都有一定的選擇性和局限性。目前，還沒(méi)有一種方法能單獨(dú)完成各種物種各種水平的檢測(cè)。所以，只有聯(lián)合各種鑒別方法，充分利用各種方法的優(yōu)勢(shì)，才能得到更為便捷、準(zhǔn)確和靈敏的乳酸菌的分類和鑒別。

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