王海濤，方以群

氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness，AHR)是過敏性哮喘的顯著特點，可直接導(dǎo)致哮喘患者氣管平滑肌和支氣管發(fā)生過度收縮，引發(fā)一系列以小支氣管明顯痙攣收縮為特征的臨床病癥［1］。主要堿性蛋白(major basic protein，MBP)是一種活化嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)脫顆粒產(chǎn)生的低分子量、高陽離子蛋白，是包括支氣管哮喘在內(nèi)的多種氣道炎癥性疾病的主要標志物之一［2］。MBP能夠通過抑制神經(jīng)元M2型毒蕈堿受體(muscarinic M2receptor，M2R)功能，引發(fā)大量乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)的釋放，導(dǎo)致支氣管收縮和AHR。本綜述對MBP結(jié)構(gòu)、功能作用及其與AHR的關(guān)系等的研究情況進行介紹。

1 MBP的結(jié)構(gòu)

MBP不僅存在于EOS，而且在肥大細胞和嗜堿性粒細胞內(nèi)也有一定表達。人類MBP基因序列定位在11號染色體，人類MBP與豚鼠MBP抗血清存在交叉反應(yīng)性，兩者的單克隆抗體也存在＞86%的交叉反應(yīng)性。

MBP是一個序列特征不顯著的C型凝集素(CTL)超家族成員。人MBP包含117個氨基酸殘基，其中有17個精氨酸殘基和7個賴氨酸殘基，還含有9個半胱氨酸殘基［3］。MBP最初是以1個含222個氨基酸殘基的前體蛋白形式(pro-MBP)合成的，包含1個16-氨基酸殘基信號肽、89個氨基酸殘基前體片段和含117個氨基酸殘基。在pro-MBP胞內(nèi)轉(zhuǎn)運至進行蛋白酶解加工過程和MBP儲存在EOS顆粒期間，強酸性前體片段發(fā)揮了中和基本MBP結(jié)構(gòu)域作用的效能。第1基因座控制區(qū)(pro-MBP 123～150氨基酸殘基)主要有顯著細胞毒性;第2基因座控制區(qū)(pro-MBP 194～222氨基酸殘基)在促進嗜堿性粒細胞釋放組胺方面更具高效性［4］。pro-MBP在細胞質(zhì)顆粒中水解生成14 kD MBP，儲存在EOS分泌性“特異”顆粒的高電子密度的結(jié)晶核心。EOS活化后，MBP被分泌到分泌小泡，逐步以脫顆粒的形式釋放［5］。

2 MBP對呼吸系統(tǒng)的病理生理作用

MBP對腫瘤細胞及脾臟、腸道、內(nèi)皮細胞、氣道上皮細胞等哺乳動物的多種細胞有毒性作用。MBP能激活組胺釋放和減弱細胞免疫應(yīng)答，促進炎癥進程。MBP能夠引發(fā)氣道上皮細胞損傷，增加氣道上皮細胞前列腺素合成，誘導(dǎo)嗜堿性粒細胞和肥大細胞釋放組胺，介導(dǎo)氣道平滑肌收縮，加速氣道水腫發(fā)生，提高氣道對致痙原的反應(yīng)性等。Kato等［6］的研究表明，MBP可損傷呼吸道合胞體病毒感染的支氣管上皮細胞，說明MBP與呼吸道合胞體病毒感染誘發(fā)的哮喘急性加重有關(guān)。

MBP是M2R選擇性、內(nèi)源性變構(gòu)拮抗劑。肺臟含有M2R、M3型毒蕈堿受體(M3R)等多種亞型毒蕈堿受體。肺的副交感神經(jīng)末稍釋放的ACh激活M3R，作用于氣道平滑肌，引發(fā)其收縮，導(dǎo)致支氣管收縮。同時，副交感神經(jīng)的ACh釋放到神經(jīng)末梢時會受到M2R的抑制作用。應(yīng)用選擇性拮抗劑阻斷神經(jīng)性M2R的負反饋抑制作用，可8～10倍地增大電刺激迷走神經(jīng)引發(fā)的支氣管收縮效果。相反，應(yīng)用毛果蕓香堿興奮M2R可降低上述效果的80%［7］。MBP能夠顯著增強肺C纖維對于肺膨脹和化學性刺激的敏感性。C型輸入神經(jīng)纖維激活后，輸入感受器編碼以動作電位形式的神經(jīng)沖動傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，誘發(fā)肺化學反射(包括呼吸暫停、心動過緩和低血壓)和其他諸如支氣管收縮、支氣管血管舒張、呼吸困難和咳嗽等心肺反射［2］。MBP通過增強內(nèi)向電流及動作電位的途徑對肺感覺神經(jīng)元發(fā)揮直接的電荷依賴的長效致敏效應(yīng)，導(dǎo)致在病理生理條件下發(fā)生與EOS氣道滲入有關(guān)的AHR。75%迷走神經(jīng)的支氣管肺傳入纖維是無髓鞘(C類)纖維，興奮后能引發(fā)支氣管收縮、黏液分泌過多及其他由膽堿能反射和內(nèi)源性速激肽類介導(dǎo)的對氣道功能的影響［8］。MBP可引起肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放組胺、活化嗜中性粒細胞和肺泡巨噬細胞，直接與哮喘的上皮細胞損害、支氣管痙攣等相關(guān)。向猴子肺內(nèi)灌注MBP，除了可引起支氣管痙攣外，還可使支氣管高反應(yīng)性增高10倍［9］。另外，MBP還可通過蛋白激酶C和細胞內(nèi)Ca2+介導(dǎo)II型肺泡壁細胞對磷脂酰膽堿的分泌［10］。

3 MBP表達的影響因素

MBP mRNA的表達水平隨著EOS的發(fā)育而逐步增加，隨著EOS的成熟而減少。EOS始于造血干細胞和骨髓祖細胞的分化過程，最初受白細胞介素3(IL-3)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-5的調(diào)控;隨后，IL-5特異地影響EOS的終末分化、功能激活等。

EOS經(jīng)CC-基序趨化因子受體3(CCR3)激動劑募集到氣道神經(jīng)周圍及經(jīng)細胞內(nèi)細胞黏附分子1(ICAM-1)和血管細胞粘附分子(VCAM)黏附到氣道神經(jīng)上，通過鈣內(nèi)流、增加CD11和CD18表達、活化ERK和p38 MAPK、增加生成活性氧、肌動蛋白聚合和脫顆粒及EOS活化趨化因子、P物質(zhì)、ICAM-1和VCAM等激活EOS，釋放MBP。除EOS活化趨化因子外，EOS活化趨化因子-2，-3、單核細胞趨化蛋白-2，-3，-4、RANTES、CCL15和CCL28等與CCR3結(jié)合的趨化因子也可能參與了對EOS的激活過程［11］。

ICAM-1和EOS活化趨化因子是EOS化學誘導(dǎo)至神經(jīng)的關(guān)鍵因子。TNF-α能上調(diào)EOS活化趨化因子和ICAM-1的表達，還能增加 IL-5的表達和降低 M2R mRNA穩(wěn)定性。TNF-ɑ可能間接增加EOS增殖，遷移和黏附到副交感神經(jīng)上，促進EOS募集反應(yīng)，增加生成MBP，抑制M2R功能［12］。

另外，GM-CSF、IL-1、IL-3、IL-5可能對EOS有不同程度的活化作用。Meyts等［13］研究顯示，IL-12抗體可降低支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中CD4+T細胞數(shù)量和IL-4、IL-5、IL-13水平及肺IL-10、EOS活化趨化因子、RANTES、MCP-1、VCAM-1 mRNA表達水平;在氣道激發(fā)階段通過干擾素 γ介導(dǎo)，減低 EOS活化趨化因子、RANTES、MCP-1、VCAM-1 mRNA的表達水平，說明IL-12很可能通過上述細胞因子影響MBP的生成。

除上述影響因素外，EOS顆粒發(fā)育基因(eosinophil granule ontogeny，EGO)——一種新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA表達基因被沉默后，MBP mRNA的表達水平僅為對照的9%，表明EGO是MBP基因正常轉(zhuǎn)錄表達的一個必要因子［14］。另外，GATA-2在MBP P2啟動子反式激活過程中充當了GATA-1的競爭性抑制劑，也能抑制GATA-1約50%活性，發(fā)揮對MBP表達的負向調(diào)節(jié)作用。

4 MBP調(diào)控的細胞因子

MBP可顯著上調(diào)ET-1、TGF-ɑ、TGF-β1、EGFR、PDGF-β、MMP-9、腱糖蛋白和纖維連接蛋白的mRNA表達水平，下調(diào)MMP-1基因表達水平，促進MMP-1、MMP-9、ET-1、PDGF-AB蛋白分子生成，在支氣管上皮修復(fù)、肺氣管結(jié)構(gòu)重塑、誘導(dǎo)成纖維細胞分化為成肌纖維細胞及調(diào)控氣道平滑肌細胞增殖、趨化、激活、細胞外基質(zhì)的更新、降解等過程中發(fā)揮重要作用。MBP還可與IL-1ɑ和TGF-β1協(xié)同增加IL-6類細胞因子mRNA和蛋白質(zhì)的生成量［15］。

MBP能誘導(dǎo)肥大細胞和嗜堿性粒細胞組胺釋放、EOS和成纖維細胞IL-8分泌、前列腺素和離子分泌，與哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病的介導(dǎo)機制有關(guān)。在氣道上皮細胞，MBP可增加前列腺素E2和F2ɑ的合成，減弱纖毛運動性，誘發(fā)細胞損傷［16］。MBP可激活上皮細胞表面的鈣感受器，促進成纖維細胞生長因子9生成，導(dǎo)致基底細胞增生［17］。Page等［18］研究表明，MBP可有效刺激中性粒細胞，通過調(diào)控IL-8的基因轉(zhuǎn)錄增加生成IL-8，導(dǎo)致急性哮喘及其他炎癥性肺疾病的發(fā)生。MBP也能短暫升高MIP-1α和MIP-1β mRNA表達水平，但未能促進MIP-1α或MIP-1β的蛋白生成量。

5 MBP與AHR的關(guān)系及其在病理過程中的作用

在絕大多數(shù)動物中，氣道M2R的含量明顯高于M3R(由于動物種系不同，M2R含量為毒蕈堿性受體總量的50%～80%)。經(jīng)檢測M2R和M3R mRNA存在于人類支氣管中［1］。M2R功能的降低與病毒感染、變應(yīng)原激發(fā)、臭氧暴露、有機磷酸鹽暴露和哮喘病理過程中發(fā)生的AHR密切相關(guān)。應(yīng)用肝素中和MBP對M2R的拮抗作用，快速恢復(fù)M2R功能可有效逆轉(zhuǎn) AHR［19］。氣管內(nèi)滴入 MBP可誘發(fā)支氣管收縮和AHR［8］。依那西普、地塞米松可通過抑制EOS募集至氣道神經(jīng)周圍，保護神經(jīng)元M2R功能免受MBP拮抗作用而阻止AHR的發(fā)生［12，20］。

AHR的主要機制是MBP阻斷副交感神經(jīng)M2R對ACh釋放的抑制功能，增加釋放到氣道平滑肌上M3R的ACh量和增強迷走神經(jīng)誘發(fā)的支氣管收縮。阻斷M2R功能可5～10倍地增大迷走神經(jīng)誘發(fā)的支氣管收縮。EOS經(jīng)CCR3激動劑募集到氣道神經(jīng)周圍，經(jīng)ICAM-1、VCAM黏附到氣道神經(jīng)上，釋放MBP。阻斷或抑制EOS向肺的遷移及阻斷MBP抑制功能均能有效保護M2R功能，阻止AHR發(fā)生。

在正常生理條件下，副交感神經(jīng)末梢對ACh的釋放受M2R抑制。ACh或毛果蕓香堿等毒蕈堿激動劑興奮M2R，通過抑制ACh的釋放減輕迷走神經(jīng)誘發(fā)的支氣管收縮。相反，M2R功能的喪失或被拮抗劑阻斷將導(dǎo)致ACh釋放增多，增強誘發(fā)支氣管收縮。MBP抗體阻止了M2R功能障礙及其相關(guān)的AHR的發(fā)生，說明是MBP阻遏了神經(jīng)元M2R功能，導(dǎo)致了AHR。在急性副流感病毒感染、變應(yīng)原致敏和激發(fā)及臭氧的急性暴露所導(dǎo)致的哮喘中，肺副交感神經(jīng)上的M2R均發(fā)生了功能障礙，表明M2R功能缺失是AHR重要的病理機制。MBP可阻遏M2R功能，顯著增加ACh釋放量，增大10倍迷走神經(jīng)誘發(fā)的支氣管收縮效果［1］。在致命性哮喘患者和變應(yīng)原激發(fā)的動物模型的氣道神經(jīng)周圍，活化的EOS簇生成群，脫顆粒生成MBP，阻斷M2R功能消除對ACh釋放的負反饋性調(diào)控作用，增加氣道張力和增強迷走神經(jīng)介導(dǎo)的支氣管收縮。EOS在M2R功能缺失和繼發(fā)的AHR的病理過程中發(fā)揮了特有的作用［11］。另外，M2R還能經(jīng)活化的腺苷酸環(huán)化酶抑制平滑肌舒張，增加釋放的ACh可能進一步增強M2R介導(dǎo)對腺苷酸環(huán)化酶的抑制作用。當然，M2R的合成減少也可能是其功能降低的病理機制［1］。

另外，氣道平滑肌內(nèi)的M3R經(jīng)百日咳病毒毒素肺敏感性G蛋白(GTP-結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白)與磷脂酶C偶聯(lián)，激活的磷脂酶C再催化由膜磷脂磷脂酰肌醇4，5-二磷酸生成肌醇三磷酸、二酰甘油和經(jīng)激活的蛋白激酶發(fā)生蛋白質(zhì)磷酸化，也可介導(dǎo)氣道平滑肌收縮［1］。

6 結(jié)束語

EOS募集到氣道神經(jīng)，活化后釋放MBP，抑制M2R對副交感神經(jīng)ACh釋放的負性調(diào)節(jié)作用，引起ACh釋放明顯增多，作用于氣道平滑肌上M3R，導(dǎo)致發(fā)生AHR。顯而易見，EOS(特別是活化的EOS)和MBP與AHR直接相關(guān)。但是，以往研究在哪些檢測指標能較為準確地反映三者之間關(guān)系的問題上存在一定的分歧。有研究表明，在支氣管哮喘的病理生理過程中，EOS脫顆粒的意義要遠大于其數(shù)量的增多［21］。AHR與BALF或氣道組織中的EOS含量沒有直接相關(guān)性，但與沉積在氣道和氣道神經(jīng)周圍的MBP和活化EOS的含量密切相關(guān)。相一致的是，Evans等［20］的研究表明，地塞米松在通過抑制EOS募集至氣道神經(jīng)周圍，保護神經(jīng)元M2R功能免受MBP拮抗作用而阻止AHR發(fā)生時，并沒有引起B(yǎng)ALF中EOS含量變化。Yost等［19］的實驗結(jié)果還顯示，豚鼠在臭氧暴露后，肺EOS數(shù)量在14 h開始減少;隨后在48 h開始明顯增多，至少維持至少4 d，說明EOS數(shù)量并不是維持不變的，而是隨著病程演進反復(fù)變化的。相反，Homma等［22］研究卻表明，BALF中EOS數(shù)量和MBP水平與哮喘的嚴重程度具有相關(guān)性。在死因為哮喘持續(xù)狀態(tài)的患者中，MBP存在于受損上皮細胞的表面和氣道黏膜和黏液中，完全抑制呼吸上皮纖毛運動和對呼吸上皮造成毒性損害，發(fā)生AHR，表明嚴重哮喘與氣道管腔內(nèi)EOS和MBP存有重要的關(guān)聯(lián)。

筆者認為，在研究EOS、MBP與AHR關(guān)系及其相關(guān)的呼吸系統(tǒng)疾病時，應(yīng)盡量以氣道黏膜、神經(jīng)周圍蛋白分子(EOS應(yīng)以在氣道神經(jīng)周圍活化的EOS作為檢測指標)及其基因表達作為主要依據(jù)，而以其在BALF、組織及血漿中的表達結(jié)果作為參考，進行MBP相關(guān)性分子生物學功能及機制的研究，才能獲得可信度高的實驗結(jié)果。

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(本文編輯:甘輝亮、莫琳芳)