汪 巍， 王麗娜， 許 枬， 賈天柱

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 大連 116600)

柴胡為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，稱之為地熏、茈胡?！侗静菥V目》稱柴胡是“引清氣退熱必用之藥”。 現(xiàn)代對(duì)柴胡的化學(xué)成分及藥理作用做了大量深入的研究，表明柴胡的化學(xué)成分主要有皂苷、黃酮、揮發(fā)油、多糖、脂肪酸、甾醇、氨基酸及微量元素等成分，具有解熱、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗病毒、抗細(xì)菌內(nèi)毒素、降血脂、保肝利膽、促進(jìn)酶分泌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗驚厥等藥理作用。

柴胡傳統(tǒng)炮制方法有多種，主要的有清炒、醋制、鱉血制、酒制和蜜制五種?，F(xiàn)行《中國(guó)藥典》中僅收載南、北柴胡及其醋炙品。清代《本經(jīng)逢原》柴胡項(xiàng)下提出“入解表藥生用，清肝炒熟用”?，F(xiàn)在臨床應(yīng)用也認(rèn)為生柴胡的升散作用較強(qiáng)，多用于解表退熱；醋柴胡可以緩和升散及解表退熱作用，并可增強(qiáng)疏肝止痛作用，多用于肝郁氣滯的脅痛、腹痛及月經(jīng)不調(diào)等癥。柴胡醋制前后保肝作用是否存在差異？故課題組針對(duì)柴胡醋制前后的保肝作用進(jìn)行比較研究，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)柴胡醋制前后抗肝纖維化作用進(jìn)行考察。選用豬血清致大鼠免疫損傷性肝纖維化模型，通過ELISA法測(cè)定大鼠血清中PCⅢ、ColⅣ、HA、LN、FN的水平，結(jié)合肝組織切片及HE化學(xué)染色觀察，比較柴胡醋制前后抗肝纖維化作用差異。

1 材料和方法

1.1 飲片來(lái)源 柴胡飲片購(gòu)于遼寧正大祥和藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)201105245，產(chǎn)地遼寧。

1.2 醋柴胡飲片的制備 生柴胡加入定量米醋(每100 kg用米醋20 kg)拌勻，稍燜潤(rùn)，待醋被吸盡后，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱，炒干，取出晾冷。

1.3 柴胡水煎液的制備 分別將生柴胡和醋柴胡用水煎煮制成1∶2水煎劑(相當(dāng)于生藥)，備用。

1.4 試劑 豬血清(北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)120418)；聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號(hào)H33020232)；大鼠Ⅲ型前膠原(PC Ⅲ)、大鼠Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)、大鼠黏連蛋白(LN)、大鼠透明質(zhì)酸(HA)、大鼠纖維連接蛋白(FN)酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購(gòu)于上?？婆d商貿(mào)有限公司，批號(hào)201211。

1.5 儀器 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào),TGL-16C);酶標(biāo)儀(Thermo上海儀器有限公司，型號(hào)，MULTISKAN MK3)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；奧林巴斯BX51顯微鏡。

1.6 動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠，體質(zhì)量130～150 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供許可證號(hào)SCXK(遼)2008-0002，清潔級(jí)(CL)。大鼠常規(guī)喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為生柴胡組、醋柴胡組、空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性對(duì)照組。

1.7 實(shí)驗(yàn)方法

1.7.1 造模及給藥 選用豬血清誘導(dǎo)免疫損傷性肝纖維化模型，參照文獻(xiàn)[1]方法進(jìn)行造模。大鼠稱質(zhì)量后各組動(dòng)物以10 mL/kg劑量灌胃給藥，空白組和模型組給同體積生理鹽水，陽(yáng)性藥組灌胃聯(lián)苯雙酯0.15 g/kg。給藥同時(shí)每只大鼠腹腔注射血清0.5 mL，每周2次，連續(xù)8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束采集樣本前，所有大鼠禁食不禁水12 h，于第8周末，末次給藥后處死大鼠，取血清進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，取肝臟組織做組織切片。

1.7.2 肝纖維化指標(biāo)檢測(cè) 大鼠眼內(nèi)眥取血，3 000 r/min離心5 min,取血清，ELISA法檢測(cè)PC Ⅲ、Col Ⅳ、LN、 FN、HA水平。

1.7.3 肝臟病理組織學(xué)檢查 脫頸椎處死大鼠，取大鼠肝臟組織，切取同一葉同一部位小塊肝組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)制片與HE染色，普通光鏡下觀察病理組織學(xué)變化。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 柴胡及其醋制品對(duì)肝纖維化大鼠各項(xiàng)血清指標(biāo)的影響與正常組大鼠比較，模型組大鼠血清PCⅢ、ColⅣ、HA、LN、FN明顯升高，與模型組比較，聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性組，生、醋柴胡組大鼠各血清指標(biāo)均有下降，醋柴胡與陽(yáng)性藥組呈顯著下降。結(jié)果見表1、表2。

表1 生、醋柴胡對(duì)PCⅢ、ColⅣ的影響

表2 生、醋柴胡對(duì)HA、LN、FN的影響

2.2 柴胡及醋制品對(duì)肝纖維化大鼠肝臟病理組織學(xué)的影響 正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞大小正常，肝細(xì)胞索排列有序、肝血竇腔隙規(guī)則，無(wú)纖維組織增生，肝細(xì)胞無(wú)變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠顯微鏡下可見肝小葉間大量纖維組織增生，中央靜脈不規(guī)則，與匯管區(qū)交織成網(wǎng)，形成纖維間隔，肝細(xì)胞大面積變性、壞死，肝細(xì)胞索排列紊亂，可見大小不等脂肪細(xì)胞，細(xì)胞間質(zhì)可見大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。陽(yáng)性藥組大鼠肝小葉組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)與模型組比較有明顯的好轉(zhuǎn)，小葉間增生的纖維組織明顯變薄及消失，脂肪細(xì)胞、炎性細(xì)胞減少，壞死的肝細(xì)胞也有所改善。生柴胡組與模型組比較，肝小葉組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)有所改善，仍可見肝小葉間粗細(xì)不勻、增生的纖維組織形成纖維間隔，少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及散在的脂肪細(xì)胞，肝細(xì)胞壞死有所好轉(zhuǎn)。醋柴胡組與模型組比較，肝小葉組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)恢復(fù)較好，肝小葉間纖維組織增生基本消失，肝細(xì)胞大小基本正常， 偶爾可見間質(zhì)有散在的炎性細(xì)胞及脂肪細(xì)胞， 肝細(xì)胞索排列較好。

3 討論

肝纖維化是由過多的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肝內(nèi)沉積所導(dǎo)致的，伴隨著肝纖維化的進(jìn)程,ECM的量和成分也會(huì)發(fā)生變化。而ECM的主要成分是膠原，主要是Ⅰ、 Ⅲ和Ⅳ型膠原，尤其是Ⅰ和Ⅲ型是肝纖維間隔的重要來(lái)源。ECM的其他成分還包括有粗纖維調(diào)節(jié)素、纖維連接蛋白(FN)、彈性蛋白、層黏連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)和蛋白多糖[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示醋柴胡組和陽(yáng)性藥組能夠明顯降低豬血清所導(dǎo)致的免疫損傷性肝纖維化大鼠Ⅳ型膠原酶、Ⅲ型前膠原酶、層黏連蛋白(LN)酶、透明質(zhì)酸(HA)酶、纖維連接蛋白(FN)水平，降低肝組織纖維化程度。提示醋柴胡對(duì)免疫損傷性肝纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積起到抑制作用，從而起到降低肝纖維化程度，恢復(fù)肝臟功能的作用。

柴胡皂苷為柴胡主要有效成分之一，藥理活性較強(qiáng)。已經(jīng)明確，柴胡皂苷具有解熱、鎮(zhèn)靜、明顯的中樞抑制、抗炎、特異性阻礙膽堿酯酶、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗肝纖維化、抗腫瘤、止痛、抗菌、保肝、抗腎炎、利尿等作用[3-5]。豬血清誘導(dǎo)大鼠免疫損傷性肝纖維化的原理主要是豬血清能夠刺激大鼠產(chǎn)生抗豬血清的抗體，形成免疫化合物沉積于肝竇和血管壁上，激活補(bǔ)體，引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，釋放炎癥介質(zhì)，造成肝細(xì)胞損傷、壞死，形成纖維化。而有研究[6]認(rèn)為柴胡皂苷正是通過其自身抗炎和免疫調(diào)節(jié)的生物特性，實(shí)現(xiàn)其對(duì)肝纖維化機(jī)制的干預(yù)，首先通過抗炎作用減少細(xì)胞炎性介質(zhì)的釋放，阻止其啟動(dòng)和加劇肝纖維化過程；其次抑制肝星狀細(xì)胞激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，平衡免疫系統(tǒng)，阻止因細(xì)胞因子瀑布效應(yīng)導(dǎo)致ECM過度沉積，從而起到抗肝纖維化的關(guān)鍵作用。從而證明柴胡皂苷是柴胡抗肝纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。另有實(shí)驗(yàn)研究[7]證實(shí):柴胡總皂苷可以改善四氯化碳所致的大鼠肝纖維化，并且具有一定的量效關(guān)系。且有研究[8-9]表明生藥加工成飲片后，總皂苷量降低，而經(jīng)醋制后較生品有所升高。表明醋制后柴胡總皂苷的溶出率有所提高。有研究證明柴胡皂苷只有苷元才具有藥理作用。而在柴胡中只有部分皂苷以苷元形式存在，在醋制的過程中，米醋提供了酸性的條件，炒制的過程又提供了高溫，這有助于柴胡皂苷水解成苷元和糖類，從而增強(qiáng)部分藥理作用。這也進(jìn)一步說明了柴胡醋制后抗肝纖維化的作用優(yōu)于生柴胡的原因。

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