李勝陶， 王洪新， 楊 娟， 魯美麗， 張 靜

(遼寧醫(yī)學(xué)院心腦血管藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121001)

黃芪多糖(Polysaccharide fromAstragaliRadix)是中藥黃芪中的主要活性成分之一，也是目前臨床和藥理研究較為深入的中藥成分之一，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用并能改善心臟功能及炎癥抑制作用[1]。最近，關(guān)于炎癥信號(hào)通路及炎癥因子在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用越來(lái)越受到重視。有研究表明，炎癥因子在促進(jìn)左心室重構(gòu)中起到重要作用，包括導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、胚胎基因表達(dá)、促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡等[2-3]。Toll樣受體(Toll-like receptors)最突出的生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)[4]。Toll 樣受體是心血管疾病發(fā)展與免疫系統(tǒng)之間的橋梁，其中TLR4被認(rèn)為與人類(lèi)心血管疾病關(guān)系最為密切[5-6]，TLR4是介導(dǎo)心肌肥厚炎癥信號(hào)的重要受體，TLR4的活化可使NF-κB的表達(dá)增加，進(jìn)而引起一系列炎性因子的表達(dá)，相反NF-κB的活性對(duì)TLR4也具有調(diào)節(jié)作用[7]。Serra等[8]研究發(fā)現(xiàn)，異丙腎上腺素(Isoprenaline，ISO)誘導(dǎo)心肌肥厚可使心肌組織中TNF-α和IL-6的基因表達(dá)增加，同時(shí)也使NF-κB表達(dá)增加。但異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌肥厚的過(guò)程中，TLR4表達(dá)是否增加目前尚無(wú)報(bào)道。已有研究證實(shí)黃芪多糖對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大有保護(hù)作用[9]。然而黃芪多糖對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌肥厚的保護(hù)作用是否通過(guò)阻斷TLR4/NF-κB通路這一途徑，目前尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用異丙腎上腺素制作心肌肥厚模型，探討TLR4/NF-κB通路在黃芪多糖保護(hù)心臟過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品和試劑 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，4～6 周齡，體質(zhì)量180～200 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(遼)20030007。黃芪多糖購(gòu)自陜西森弗生物技術(shù)有限公司(批號(hào)HQ090312)，純度為98%；異丙腎上腺素、普萘洛爾(美國(guó) Sigma 公司)，TNF-α和IL-6 ELISA 試劑盒均購(gòu)自 R&D 公司；TLR4一抗、IκBα一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)和p65一抗(美國(guó)Proteintech Group公司)；Trizol試劑、RT-PCR 試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物模型制備、實(shí)驗(yàn)分組和給藥方法 SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組(每組10只):對(duì)照組，異丙腎上腺素組，異丙腎上腺素+黃芪多糖200 mg/(kg·d)組，異丙腎上腺素400 mg/(kg·d)組，異丙腎上腺素800 mg/(kg·d)組，異丙腎上腺素+普萘洛爾40 mg/(kg·d)組。給藥組連續(xù)腹腔注射3周，并于給藥1 d后腹腔注射異丙腎上腺素 5 mg/(kg·d)2周；正常對(duì)照組和異丙腎上腺素組大鼠都給予相同體積的生理鹽水。

1.3 心臟質(zhì)量參數(shù)測(cè)定 麻醉后迅速開(kāi)胸，去血清置于-20 ℃ 冰箱保存。抽取血標(biāo)本后取出心臟，修剪周?chē)M織和血管，稱(chēng)量全心質(zhì)量(Heart weight，HW)和左心室質(zhì)量(Left ventricle weight，LVW)。計(jì)算全心質(zhì)量指數(shù)(Heart mass index，HMI=HW/BW)和左室質(zhì)量指數(shù)(Left ventricle mass index ，LVMI=LVW/BW)。

1.4 HE染色檢測(cè)心肌組織改變 橫向取甲醛固定好的左心室心肌部分約0.5 cm，常規(guī)石蠟包埋、切片(5 μm)，HE染色后，光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)心肌組織 ANP 和 TLR4 mRNA的表達(dá) 取約100 mg心肌組織，用TRIzol 法提取心肌組織總 RNA，取約1 μg總 RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。ANP引物：上游引物GGG CTC CTT CTC CAT CAC，下游引物CCC TCA GTT TGC TTT TCA(344 bp)。TLR4引物：上游引物CTA TCA TCA GTG TAT CGG TG, 下游引物CAG TCC TCA TTC TGG CTC(186 bp)。內(nèi)參GAPDH的引物序列上游引物AAT GCA TCC TGC CAC CAC CAA CTG C, 下游引物GGA GGC CAT GTA GTA GGC CAT GAG GTC(550 bp)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 45 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min 15 s。電泳結(jié)束后，取置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，用凝膠圖像分析系統(tǒng)軟件對(duì) RT-PCR 產(chǎn)物電泳條帶進(jìn)行密度分析，以 GAPDH 為內(nèi)參，根據(jù)心鈉素(ANP)、TLR4和GAPDH密度分析結(jié)果比值，計(jì)算得到ANP、TLR4的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Western Blot 法測(cè)定心肌組織TLR4、p65和IκBα蛋白表達(dá) 選取心肌組織放于無(wú)菌EP管中，加入裂解緩沖液(RIPA)，提取總蛋白。蛋白定量(BCA) 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，灌膠上樣進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察標(biāo)記移動(dòng)情況，根據(jù)所需適時(shí)終止電泳。取出電泳凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，然后將得到的PVDF膜浸入封閉液置于搖床上緩慢搖1 h以上，洗膜，切割后分別按照對(duì)應(yīng)分子量置于稀釋過(guò)的TLR4、p65和IκBα一抗溶液中，4 ℃ 雜交過(guò)夜，用洗膜液漂洗后加入稀釋的二抗，搖床上雜交 1 h，然后取出用洗膜液沖洗，然后加ECL顯色，上機(jī)檢測(cè)。

1.7 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清 TNF-α、IL-6水平 備好“1.3”項(xiàng)步驟中的血清標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 法檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-6蛋白濃度。在無(wú)菌條件下按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 不同處理因素對(duì)大鼠心臟指數(shù)的影響 表1結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，異丙腎上腺素組大鼠的HMI和LVMI分別增加了37.40%、35.35%(P<0.01)，表明大鼠心肌肥厚模型成功，心臟整體形態(tài)發(fā)生改變。同異丙腎上腺素組相比較，黃芪多糖400、800 mg/(kg·d)和普萘洛爾40 mg/(kg·d)組大鼠HMI和LVMI明顯降低(P<0.05，P<0.01)，說(shuō)明黃芪多糖可有效減輕異丙腎上腺素所致的心肌肥厚。

表1 不同處理因素對(duì)大鼠HMI和LVMI的影響

2.2 不同處理因素對(duì)大鼠心肌病理變化的影響 HE染色切片在顯微鏡下觀察，對(duì)照組心肌細(xì)胞形態(tài)均勻，心肌纖維排列整齊(圖1A)。異丙腎上腺素組心肌細(xì)胞較寬大，肌束纖維排列紊亂且疏松水腫，界限不清，且有局灶性壞死，肌束內(nèi)可見(jiàn)局灶性纖維組織增生，間質(zhì)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)。與異丙腎上腺素組相比較，黃芪多糖 200 mg/(kg·d)組心肌纖維未見(jiàn)恢復(fù)(圖1C)；黃芪多糖400 mg/(kg·d)組心肌纖維部分恢復(fù)，但仍見(jiàn)少部分區(qū)域心肌纖維腫脹，肌纖維紊亂程度減輕，間質(zhì)中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少(圖1D)；黃芪多糖800 mg/(kg·d)組和普萘洛爾40 mg/(kg·d)組心肌纖維恢復(fù)良好，排列恢復(fù)整齊，形態(tài)基本保持一致(圖1E、1F)。

2.3 心肌組織ANP、TLR4 mRNA的表達(dá) 心鈉素(Atrial natriuretic peptide，ANP)是心肌肥大的標(biāo)志性基因之一，通常肥大的心肌組織較正常心肌組織中ANP mRNA表達(dá)增加。 圖2所示為各組大鼠心肌組織ANP、TLR4 mRNA的表達(dá)水平。同對(duì)照組相比，異丙腎上腺素組大鼠心肌組織ANP、TLR4mRNA表達(dá)分別增加了44.27%、60.12%(P<0.01)。與異丙腎上腺素組相比，黃芪多糖各劑量組和普萘洛爾40 mg/(kg·d)組ANP、 TLR4 mRNA的表達(dá)減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。表明黃芪多糖對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚有保護(hù)作用，其可能是通過(guò)抑制TLR4 mRNA 的表達(dá)。

圖1 不同處理因素對(duì)大鼠心肌病理變化的影響(HE×400)

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與異丙腎上腺素組相比較，#P<0.05，##P<0.01 1.對(duì)照組 2.異丙腎上腺素組 3.異丙腎上腺素+黃芪多糖 200 mg/(kg·d) 4.異丙腎上腺素+黃芪多糖400 mg/(kg·d)組5. 異丙腎上腺素+黃芪多糖800 mg/(kg·d)組 6.異丙腎上腺素+普萘洛爾40 mg/(kg·d)組

2.4 心肌組織TLR4、p65和IκBα蛋白的表達(dá) 圖3所示為各組大鼠心肌組織TLR4、p65和IκBα蛋白的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，異丙腎上腺素組TLR4、p65表達(dá)水平分別增加，IκBα 表達(dá)水平減少(P<0.01)。與異丙腎上腺素組相比，黃芪多糖各劑量組和普萘洛爾40 mg/(kg·d)組TLR4、P65表達(dá)水平分別減少，IκBα 表達(dá)水平升高(P<0.05，P<0.01)。表明黃芪多糖可能通過(guò)抑制IκBα 降解，抑制TLR4、 p65 的表達(dá)而保護(hù)心臟。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與異丙腎上腺素組相比較，#P<0.05，##P<0.01 1.對(duì)照組 2.異丙腎上腺素組 3.異丙腎上腺素+ 黃芪多糖 200 mg/(kg·d) 4.異丙腎上腺素+ 黃芪多糖400 mg/(kg·d) 5.異丙腎上腺素+ 黃芪多糖800 mg/(kg·d) 6.異丙腎上腺素+普萘洛爾40 mg/(kg·d)

2.5 大鼠血清中TNF-α、IL-6 的表達(dá) 表2為大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)的情況。同對(duì)照組相比較，異丙腎上腺素組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6水平明顯增加(P<0.01)。與異丙腎上腺素組相比，黃芪多糖 400 mg/(kg·d)組、黃芪多糖800 mg/(kg·d)組和普萘洛爾組 40 mg/(kg·d) 組能夠明顯減少大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6的水平(P<0.01)；黃芪多糖200 mg/(kg·d)組能夠減少血清中炎癥因子TNF-α的水平(P<0.05)。與黃芪多糖200 mg/(kg·d)組相比較，黃芪多糖400、800和普萘洛爾40 mg/(kg·d)組TNF-α、IL-6的水平明顯降低(P<0.01)，并且炎癥因子TNF-α、IL-6的水平隨著黃芪多糖的劑量遞增而呈遞減趨勢(shì)，即黃芪多糖對(duì)炎癥因子的抑制作用呈劑量依賴(lài)性，表明黃芪多糖可以通過(guò)抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)來(lái)保護(hù)心肌。

表2 不同處理因素對(duì)大鼠血清中TNF-α和IL-6 表達(dá)的影響

3 討論

心肌肥厚是眾多心血管疾病共同的病理過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)肥厚的心肌中存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，而一系列的炎癥應(yīng)答會(huì)加重心肌損害，從而引起心肌收縮功能障礙及心肌重構(gòu)，最終會(huì)導(dǎo)致心力衰竭[10]。有研究表明抑制心臟的炎癥反應(yīng)可以有效防止心肌肥厚并減緩心衰的發(fā)展[11]。導(dǎo)致心肌肥厚的信號(hào)通路[12]如MAPK通路、Ca2+及其依賴(lài)的信號(hào)通路、JAK/STAT信號(hào)通路等，目前針對(duì)這些信號(hào)通路的藥物及治療策略對(duì)心臟疾病的療效與對(duì)死亡率的控制已經(jīng)不能再進(jìn)一步改善與提高。而有離體實(shí)驗(yàn)[13-14]針對(duì)TLR4/NF-κB這一炎癥信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以減緩TNF-α、脂多糖(LPS)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的炎癥因子的表達(dá)。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明[15]，阻斷NF-κB后，TLR4在腎性高血壓大鼠肥厚心肌中表達(dá)減少。所以研究黃芪多糖對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚中TLR4/NF-κB的影響具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芪多糖可以抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚，并且黃芪多糖800 mg/(kg·d)組與普萘洛爾組對(duì)心肌肥厚的保護(hù)作用相似。心臟質(zhì)量參數(shù)測(cè)定結(jié)果顯示異丙腎上腺素組大鼠全心質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)分別增加了37.40%、35.35%；在400倍顯微鏡下觀察心肌組織HE染色，發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素組心肌細(xì)胞增粗，肌束纖維排列紊亂且疏松水腫，界限不清，間質(zhì)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；心肌肥厚基因ANP mRNA的表達(dá)顯著增加，說(shuō)明大鼠心肌肥厚模型成功。而黃芪多糖800 mg/(kg·d)組能有效對(duì)抗這些改變。從RT-PCR對(duì)心肌組織TLR4 mRNA檢測(cè)水平來(lái)看，異丙腎上腺素組較對(duì)照組的表達(dá)水平明顯增加，而在黃芪多糖和普萘洛爾組TLR4 mRNA的水平降低。通過(guò)Western Blot檢測(cè)心肌組織TLR4、p65和IκBα蛋白水平結(jié)果來(lái)看，異丙腎上腺素組大鼠心肌組織TLR4、p65蛋白表達(dá)增加，而IκBα蛋白表達(dá)降低，黃芪多糖和普萘洛爾組的結(jié)果與之相反。ELISA 的結(jié)果顯示，異丙腎上腺素能引起大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6增多，黃芪多糖 800 mg/(kg·d)組和普萘洛爾組抑制炎癥因子的作用相似，并且炎癥因子TNF-α、IL-6的水平隨著黃芪多糖的劑量遞增而呈遞減趨勢(shì)，即黃芪多糖對(duì)炎癥因子的抑制作用呈劑量依賴(lài)性，表明黃芪多糖可以通過(guò)抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)來(lái)保護(hù)心肌組織。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明黃芪多糖能抑制異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚，能抑制TLR4、p65的表達(dá)和IκBα的降解，即黃芪多糖可能是通過(guò)抑制TLR4/NF-κB這一信號(hào)通路的激活來(lái)減緩組織中的炎癥因子的分泌，從而保護(hù)心臟。但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步證實(shí)，黃芪多糖用于臨床心血管疾病的治療以及與普萘洛爾對(duì)照的療效都需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

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