胡煒彥， 于浩飛， 張榮平*

(1. 昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學分子臨床研究院，云南 昆明 650500)

神經細胞氧化應激損傷是大腦衰老、疾病的病理學特征之一，因此保護神經細胞，抵抗氧化損傷有著重要的意義。海馬是中樞神經系統(tǒng)的重要組成部分，在學習記憶環(huán)節(jié)中起著十分重要的作用。在神經退行性疾病患者中，腦組織萎縮和腦實質內神經細胞數量的減少程度比正常老年人更為明顯，海馬也是最早受累的部位之一[1-2]。人參皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3)，為五加科植物人參或三七中提取分離出的微量皂苷類成分，目前，大部分的研究集中在人參皂苷Rg3抗腫瘤方面的作用[3-6]，也有文獻報道人參皂苷Rg3對腦缺血大鼠腦線粒體損傷具有明顯的保護作用，該作用可能與清除氧自由基、抑制脂質過氧化、拮抗Ca2+有關[7]。有研究證實人參及人參或三七中提取分離出的皂苷類成分(如人參皂苷Rb1、Rg1等)具有保護神經損傷的作用，能夠改善認知和學習記憶功能[8-10]。但關于人參皂苷Rg3在神經元保護方面報道較少，因此，本實驗以原代培養(yǎng)的小鼠海馬神經元為研究對象，以H2O2制備氧化應激損傷模型，研究人參皂苷Rg3預處理對H2O2所致海馬神經元損傷的保護作用。

1 材料

1.1 動物 孕18 d C57小鼠，購于昆明醫(yī)學院實驗動物中心，合格證號：SCXK(滇)-2011004。

1.2 試劑與儀器 神經元培養(yǎng)基(Neurobasal medium)、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Typsine)、杜氏磷酸緩沖液(DPBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、聚乙二醇辛基苯基醚100(Triton-X 100)、Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)、青霉素-鏈霉素(P/S)、胎牛血清(FBS)、B27、CCK-8試劑盒，L-多聚賴氨酸(PLL)等均購自Invitrogen公司。人參皂苷Rg3(云南中醫(yī)學院周志宏教授提供)。H2O2(購自Sigma公司)。

核糖核酸(RNA)提取試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)試劑盒(購自寶生物工程(大連)有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(北京博邁斯生物科技有限公司)。GAPDH及Caspase-3基因引物均由Invitrogen公司(上海)合成。GAPDH，上游引物F：TGACGTGCCGCCTGGAG AAA，下游引物R：AGTGTAGCCCAAGATGCC CTTCAG；Caspase-3，上游引物F：ACCGATGTCGAT GCAGCTAA，下游引物R：GGTGCGGTAGAGT AAGCATA。

2 方法

2.1 小鼠海馬神經元的分離和培養(yǎng) 取孕齡為18 d的C57小鼠，脫臼處死后無菌操作取出胎鼠的海馬，剪碎，0.125% Typsine 37 ℃消化15 min，用含10% FBS 的DMEM終止消化后，75 μm篩網濾過，濾液1 000 r/min離心5 min，棄上清。再次加Neurobasal medium 混懸，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加Neurobasal medium 混懸，測細胞密度，調整細胞密度為5.2 × 105個/mL，接種于用PLL(0.01% solution) 包被過的96孔板和6孔板中。培養(yǎng)至72 h后加入終質量濃度為2.5 mg/L阿糖胞苷純化神經元。于第7天用于實驗。

2.2 神經元總RNA 提取 原代培養(yǎng)的海馬神經元于培養(yǎng)第7天，加入設定濃度的人參皂苷Rg3預處理30 min，加入終濃度50.0 μmol/L的H2O2損傷神經元，人參皂苷Rg3用DMSO溶解，加入相同體積二甲基亞砜(DMSO)作試劑空白對照組。6 h后，加入Trizol裂解液，按RNA 提取試劑盒說明書操作，提取總RNA。

2.3 RT-PCR反應 RT-PCR 操作按照RT-PCR試劑盒說明書進行。反應體系及擴增條件如下：逆轉錄體系包括標本總RNA 500 ng，緩沖液 5 μL，逆轉錄酶1.25 μL, 寡核苷酸1.25 μL, 6核苷酸的隨機引物5 μL，不含RNase 的水補齊至25 μL。37℃反應15 min，85 ℃反應5 s，cDNA置4 ℃保存。

PCR反應體系包括PCR緩沖液5 μL，上游引物0.20 μL，下游引物0.20 μL，cDNA產物1 μL加熒光定量PCR參比染料 0.20 μL，不含RNase 的水 2.8 μL至總體系為10 μL。反應程序為：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s， 72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。

2.4 神經元形態(tài)觀察 原代培養(yǎng)的海馬神經元于培養(yǎng)第7天，加入設定濃度的人參皂苷Rg3預處理30 min，加入終濃度50.0 μmol/L的H2O2損傷神經元，人參皂苷Rg3用DMSO溶解，相同體積DMSO作試劑空白對照組。6 h后，置倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。

2.5 神經元細胞活力測定 原代培養(yǎng)的海馬神經元于培養(yǎng)第7天，加入設定濃度的人參皂苷Rg3預處理30 min，人參皂苷Rg3用DMSO溶解，加入相同體積DMSO作溶劑空白對照組，加入終濃度50.0 μmol/L的H2O2損傷神經元。6 h后，加入每孔加入20 μL CCK-8溶液，設定加入相應量細胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為試劑空白對照。在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育1 h。在450 nm測定吸光度。

各組細胞活力=(各組吸光度/溶劑空白對照組吸光度)×100%

2.6 培養(yǎng)液中LDH 測定 原代培養(yǎng)的海馬神經元于培養(yǎng)第7天，分別用試藥處理后，收集細胞培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說明書測定培養(yǎng)液中LDH漏出量。

2.7 細胞內SOD 活性和MDA 測定 原代培養(yǎng)的海馬神經元于培養(yǎng)第7天，分別用試藥處理后，去除原培養(yǎng)液，細胞用PBS洗2遍，每孔加入0.1 mol/L的PBS和0.05 mmol/L的EDTA(pH 8.0)1 mL，再加入1%的Triton-X 100 50 μL，將培養(yǎng)板置振蕩器振蕩1 min 使之溶解，加入25%的H3PO4100 μL，10 000×g于4 ℃離心1 h，取上清液，按說明書測定SOD 活性和MDA水平。

3 結果

3.1 人參皂苷Rg3對H2O2損傷神經元caspase-3 mRNA表達的影響 RT-PCR檢測結果顯示，50.0 μmol/L的H2O2作用于神經元6 h后，可顯著上調海馬神經元caspase-3 mRNA的表達；與模型組相比，人參皂苷Rg3預處理(10，50 μmol/L )組，caspase-3 mRNA 表達明顯下降，結果提示人參皂苷Rg3能夠逆轉H2O2引起的海馬神經元caspase-3 mRNA的表達，見表1。

表1 人參皂苷Rg3對Caspase-3 mRNA 表達的影響

3.2 人參皂苷Rg3對H2O2損傷神經元形態(tài)的影響 在倒置顯微鏡下觀察結果顯示，50.0 μmol/L的H2O2作用于神經元6 h后，神經元形態(tài)出現萎縮，軸突斷裂，細胞碎片較多。與模型組相比，人參皂苷Rg3預處理(10，50 μmol/L)組，神經元形態(tài)完好，軸突未見斷裂，細胞碎片較少，見圖1。

3.3 人參皂苷Rg3對H2O2損傷神經元細胞活力及LDH漏出的影響 CCK-8 檢測結果表明，50.0 μmol/L的H2O2作用于神經元6 h后，可顯著降低小鼠海馬神經元的活力，細胞膜通透性增大，培養(yǎng)液中LDH的水平顯著增加。與模型組相比，人參皂苷Rg3預處理(10，50 μmol/L)組，小鼠海馬神經元活力明顯增強，細胞培養(yǎng)液中LDH 的漏出量明顯降低。結果提示人參皂苷Rg3能夠逆轉H2O2引起的海馬神經元活力下降，減少LDH的漏出。見表2。

圖1 人參皂苷Rg3對神經元形態(tài)的影響

表2 人參皂苷Rg3對H2O2 損傷海馬神經元細胞活力的影響

3.4 人參皂苷Rg3對MDA水平和SOD活性的影響 與試劑空白對照組相比，小鼠海馬神經元經50.0 μmol/L的H2O2處理6 h后，培養(yǎng)液中MDA水平顯著增加，SOD活性顯著降低；預先給予人參皂苷Rg3(10，50 μmol/L) 預處理30 min，可明顯降低培養(yǎng)液中MDA水平，升高SOD活性，結果見表3。

表3 人參皂苷Rg3對H2O2損傷海馬神經元MDA水平和SOD活性的影響

4 討論

近年來隨著我國人口的迅速老齡化，中樞神經系統(tǒng)退行性疾病日益增多，給社會和家庭帶來沉重的負擔。氧化應激(oxidative stress)和凋亡在衰老中的作用越來越受到人們的重視，氧化應激導致細胞老化、死亡等氧化損傷，直接參與了多種神經退行性疾病的病理過程，氧化損傷早于病理特征性改變[11-12]。H2O2是一種較強的氧化劑，極易進入細胞內，形成高活性的氧自由基或羥基自由基，造成細胞損傷[13]。存在于細胞漿和線粒體里的一種金屬蛋白酶使神經元發(fā)生脂質過氧化反應生成MDA、SOD，能夠清除代謝產生的超氧陰離子，是體內抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。因此，測定MDA、SOD活性既可以反映細胞損傷程度又可以判斷細胞損傷原因[14-15]。

細胞活性的高低可以反映細胞的代謝與增殖。Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。

研究結果顯示H2O2(50 μmol/L)誘導海馬神經元6 h，神經元出現萎縮，軸突斷裂，細胞碎片較多，CCK-8檢測結果顯示細胞活力下降，與對照組相比細胞內MDA水平明顯升高而胞內SOD活性顯著降低，提示H2O2(50 μmol/L)所致海馬神經元損傷與脂質過氧化損傷有關，人參皂苷Rg3可提高神經元內SOD活性并顯著降低胞內MDA的水平，提高海馬神經元細胞活性，表明人參皂苷Rg3可明顯地減弱H2O2所造成的海馬神經元氧化應激損傷，其作用機制可能與增強SOD活性，抑制LDH漏出，降低MAD、cospuse-3水平有關。

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