胡煒彥， 于浩飛， 張榮平*

(1. 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2.昆明醫(yī)科大學(xué)分子臨床研究院，云南 昆明 650500)

神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激損傷是大腦衰老、疾病的病理學(xué)特征之一，因此保護神經(jīng)細胞，抵抗氧化損傷有著重要的意義。海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，在學(xué)習(xí)記憶環(huán)節(jié)中起著十分重要的作用。在神經(jīng)退行性疾病患者中，腦組織萎縮和腦實質(zhì)內(nèi)神經(jīng)細胞數(shù)量的減少程度比正常老年人更為明顯，海馬也是最早受累的部位之一[1-2]。人參皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3)，為五加科植物人參或三七中提取分離出的微量皂苷類成分，目前，大部分的研究集中在人參皂苷Rg3抗腫瘤方面的作用[3-6]，也有文獻報道人參皂苷Rg3對腦缺血大鼠腦線粒體損傷具有明顯的保護作用，該作用可能與清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、拮抗Ca2+有關(guān)[7]。有研究證實人參及人參或三七中提取分離出的皂苷類成分(如人參皂苷Rb1、Rg1等)具有保護神經(jīng)損傷的作用，能夠改善認知和學(xué)習(xí)記憶功能[8-10]。但關(guān)于人參皂苷Rg3在神經(jīng)元保護方面報道較少，因此，本實驗以原代培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)元為研究對象，以H2O2制備氧化應(yīng)激損傷模型，研究人參皂苷Rg3預(yù)處理對H2O2所致海馬神經(jīng)元損傷的保護作用。

1 材料

1.1 動物 孕18 d C57小鼠，購于昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SCXK(滇)-2011004。

1.2 試劑與儀器 神經(jīng)元培養(yǎng)基(Neurobasal medium)、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Typsine)、杜氏磷酸緩沖液(DPBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、聚乙二醇辛基苯基醚100(Triton-X 100)、Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)、青霉素-鏈霉素(P/S)、胎牛血清(FBS)、B27、CCK-8試劑盒，L-多聚賴氨酸(PLL)等均購自Invitrogen公司。人參皂苷Rg3(云南中醫(yī)學(xué)院周志宏教授提供)。H2O2(購自Sigma公司)。

核糖核酸(RNA)提取試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒(購自寶生物工程(大連)有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(北京博邁斯生物科技有限公司)。GAPDH及Caspase-3基因引物均由Invitrogen公司(上海)合成。GAPDH，上游引物F：TGACGTGCCGCCTGGAG AAA，下游引物R：AGTGTAGCCCAAGATGCC CTTCAG；Caspase-3，上游引物F：ACCGATGTCGAT GCAGCTAA，下游引物R：GGTGCGGTAGAGT AAGCATA。

2 方法

2.1 小鼠海馬神經(jīng)元的分離和培養(yǎng) 取孕齡為18 d的C57小鼠，脫臼處死后無菌操作取出胎鼠的海馬，剪碎，0.125% Typsine 37 ℃消化15 min，用含10% FBS 的DMEM終止消化后，75 μm篩網(wǎng)濾過，濾液1 000 r/min離心5 min，棄上清。再次加Neurobasal medium 混懸，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加Neurobasal medium 混懸，測細胞密度，調(diào)整細胞密度為5.2 × 105個/mL，接種于用PLL(0.01% solution) 包被過的96孔板和6孔板中。培養(yǎng)至72 h后加入終質(zhì)量濃度為2.5 mg/L阿糖胞苷純化神經(jīng)元。于第7天用于實驗。

2.2 神經(jīng)元總RNA 提取 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元于培養(yǎng)第7天，加入設(shè)定濃度的人參皂苷Rg3預(yù)處理30 min，加入終濃度50.0 μmol/L的H2O2損傷神經(jīng)元，人參皂苷Rg3用DMSO溶解，加入相同體積二甲基亞砜(DMSO)作試劑空白對照組。6 h后，加入Trizol裂解液，按RNA 提取試劑盒說明書操作，提取總RNA。

2.3 RT-PCR反應(yīng) RT-PCR 操作按照RT-PCR試劑盒說明書進行。反應(yīng)體系及擴增條件如下：逆轉(zhuǎn)錄體系包括標(biāo)本總RNA 500 ng，緩沖液 5 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1.25 μL, 寡核苷酸1.25 μL, 6核苷酸的隨機引物5 μL，不含RNase 的水補齊至25 μL。37℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，cDNA置4 ℃保存。

PCR反應(yīng)體系包括PCR緩沖液5 μL，上游引物0.20 μL，下游引物0.20 μL，cDNA產(chǎn)物1 μL加熒光定量PCR參比染料 0.20 μL，不含RNase 的水 2.8 μL至總體系為10 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s， 95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s， 72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。

2.4 神經(jīng)元形態(tài)觀察 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元于培養(yǎng)第7天，加入設(shè)定濃度的人參皂苷Rg3預(yù)處理30 min，加入終濃度50.0 μmol/L的H2O2損傷神經(jīng)元，人參皂苷Rg3用DMSO溶解，相同體積DMSO作試劑空白對照組。6 h后，置倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。

2.5 神經(jīng)元細胞活力測定 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元于培養(yǎng)第7天，加入設(shè)定濃度的人參皂苷Rg3預(yù)處理30 min，人參皂苷Rg3用DMSO溶解，加入相同體積DMSO作溶劑空白對照組，加入終濃度50.0 μmol/L的H2O2損傷神經(jīng)元。6 h后，加入每孔加入20 μL CCK-8溶液，設(shè)定加入相應(yīng)量細胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為試劑空白對照。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h。在450 nm測定吸光度。

各組細胞活力=(各組吸光度/溶劑空白對照組吸光度)×100%

2.6 培養(yǎng)液中LDH 測定 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元于培養(yǎng)第7天，分別用試藥處理后，收集細胞培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說明書測定培養(yǎng)液中LDH漏出量。

2.7 細胞內(nèi)SOD 活性和MDA 測定 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元于培養(yǎng)第7天，分別用試藥處理后，去除原培養(yǎng)液，細胞用PBS洗2遍，每孔加入0.1 mol/L的PBS和0.05 mmol/L的EDTA(pH 8.0)1 mL，再加入1%的Triton-X 100 50 μL，將培養(yǎng)板置振蕩器振蕩1 min 使之溶解，加入25%的H3PO4100 μL，10 000×g于4 ℃離心1 h，取上清液，按說明書測定SOD 活性和MDA水平。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷Rg3對H2O2損傷神經(jīng)元caspase-3 mRNA表達的影響 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，50.0 μmol/L的H2O2作用于神經(jīng)元6 h后，可顯著上調(diào)海馬神經(jīng)元caspase-3 mRNA的表達；與模型組相比，人參皂苷Rg3預(yù)處理(10，50 μmol/L )組，caspase-3 mRNA 表達明顯下降，結(jié)果提示人參皂苷Rg3能夠逆轉(zhuǎn)H2O2引起的海馬神經(jīng)元caspase-3 mRNA的表達，見表1。

表1 人參皂苷Rg3對Caspase-3 mRNA 表達的影響

3.2 人參皂苷Rg3對H2O2損傷神經(jīng)元形態(tài)的影響 在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，50.0 μmol/L的H2O2作用于神經(jīng)元6 h后，神經(jīng)元形態(tài)出現(xiàn)萎縮，軸突斷裂，細胞碎片較多。與模型組相比，人參皂苷Rg3預(yù)處理(10，50 μmol/L)組，神經(jīng)元形態(tài)完好，軸突未見斷裂，細胞碎片較少，見圖1。

3.3 人參皂苷Rg3對H2O2損傷神經(jīng)元細胞活力及LDH漏出的影響 CCK-8 檢測結(jié)果表明，50.0 μmol/L的H2O2作用于神經(jīng)元6 h后，可顯著降低小鼠海馬神經(jīng)元的活力，細胞膜通透性增大，培養(yǎng)液中LDH的水平顯著增加。與模型組相比，人參皂苷Rg3預(yù)處理(10，50 μmol/L)組，小鼠海馬神經(jīng)元活力明顯增強，細胞培養(yǎng)液中LDH 的漏出量明顯降低。結(jié)果提示人參皂苷Rg3能夠逆轉(zhuǎn)H2O2引起的海馬神經(jīng)元活力下降，減少LDH的漏出。見表2。

圖1 人參皂苷Rg3對神經(jīng)元形態(tài)的影響

表2 人參皂苷Rg3對H2O2 損傷海馬神經(jīng)元細胞活力的影響

3.4 人參皂苷Rg3對MDA水平和SOD活性的影響 與試劑空白對照組相比，小鼠海馬神經(jīng)元經(jīng)50.0 μmol/L的H2O2處理6 h后，培養(yǎng)液中MDA水平顯著增加，SOD活性顯著降低；預(yù)先給予人參皂苷Rg3(10，50 μmol/L) 預(yù)處理30 min，可明顯降低培養(yǎng)液中MDA水平，升高SOD活性，結(jié)果見表3。

表3 人參皂苷Rg3對H2O2損傷海馬神經(jīng)元MDA水平和SOD活性的影響

4 討論

近年來隨著我國人口的迅速老齡化，中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病日益增多，給社會和家庭帶來沉重的負擔(dān)。氧化應(yīng)激(oxidative stress)和凋亡在衰老中的作用越來越受到人們的重視，氧化應(yīng)激導(dǎo)致細胞老化、死亡等氧化損傷，直接參與了多種神經(jīng)退行性疾病的病理過程，氧化損傷早于病理特征性改變[11-12]。H2O2是一種較強的氧化劑，極易進入細胞內(nèi)，形成高活性的氧自由基或羥基自由基，造成細胞損傷[13]。存在于細胞漿和線粒體里的一種金屬蛋白酶使神經(jīng)元發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成MDA、SOD，能夠清除代謝產(chǎn)生的超氧陰離子，是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。因此，測定MDA、SOD活性既可以反映細胞損傷程度又可以判斷細胞損傷原因[14-15]。

細胞活性的高低可以反映細胞的代謝與增殖。Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，顏色的深淺和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系。

研究結(jié)果顯示H2O2(50 μmol/L)誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元6 h，神經(jīng)元出現(xiàn)萎縮，軸突斷裂，細胞碎片較多，CCK-8檢測結(jié)果顯示細胞活力下降，與對照組相比細胞內(nèi)MDA水平明顯升高而胞內(nèi)SOD活性顯著降低，提示H2O2(50 μmol/L)所致海馬神經(jīng)元損傷與脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)，人參皂苷Rg3可提高神經(jīng)元內(nèi)SOD活性并顯著降低胞內(nèi)MDA的水平，提高海馬神經(jīng)元細胞活性，表明人參皂苷Rg3可明顯地減弱H2O2所造成的海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，其作用機制可能與增強SOD活性，抑制LDH漏出，降低MAD、cospuse-3水平有關(guān)。

參考文獻：

[1] Coleman P D，F(xiàn)lood D G. Neuron numbers and dendritic extent in normal aging and Alzheimer’s disease[J]．NeurobiolAging，1987，8(6)：521-545.

[2] Ball M J，F(xiàn)isman M，Hachinski V.etal. A new definition of Alzheimer’s disease:a hippocampal dementia[J]．Lancet，1985，325(8419)：14-16.

[3] 陳 曦，陳 魯，人參皂苷Rg3的抗腫瘤作用研究進展[J]．中國當(dāng)代醫(yī)藥，2011，18(36)：17-18.

[4] 簡 捷，胡志方，黃 緣，人參皂苷Rg3對人胰腺癌細胞Pim-3及Bad凋亡蛋白表達的影響[J]．癌癥，2009，28(5)：461-465.

[5] 王金良，孔佩艷，徐 葳，等．人參皂苷Rg3抑制急性白血病骨髓基質(zhì)細胞HIF-1A及VEGF的表達及其機制探討[J]．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2010，32(7)：621-624.

[6] 安 寧，朱 文，馮志華，等．人參皂苷Rg3對肺癌細胞蛋白表達的影響研究[J]．中國肺癌雜志，2008，11(3)：311-320.

[7] 田京偉，傅風(fēng)華，楊建雄，20(S)-人參皂苷Rg3對腦缺血大鼠腦線粒體損傷的保護作用[J]．中國藥理學(xué)通報，2006，22(2)：216-220.

[8] Wen T C，Yoshimura H，Matsuda S，etal．Ginseng root prevents learning disability and neuronal loss in gerbils with 5-minute forebrain ischemia[J]．ActaNeuropathol，1996，91(1)：15-22.

[9] 陳志勇，杜天明，陳善成，人參皂甙Rg1對海馬電損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能和海馬神經(jīng)細胞形態(tài)的影響[J]．南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，31(6)：1039-42.

[10] Rudakewich M，Ba F，Benishin C G. Neurotrophic and neuroprotective actions of ginsenosides Rb(1) and Rg(1)[J]．PlantaMed，2001，67(6)：533-537.

[11] Aliev G，Obrenovich M E，Reddy VP，etal． Antioxidant therapy in Alzheimer’s disease：theory and practice[J]．MiniRevMedChem，2008，8(13): 1395-1406．

[12] Shi Q，Gibson G E．Oxidative stress and transcriptional regulation in Alzheimer disease[J]．AlzheimerDisAssocDisord，2007，21(4):276-291．

[13] Li W G，Miller F J J，Zhang H J，etal. H2O2-induced O2-production by a non-phagocytic NAD(P)H oxidase causes oxidant injury[J].JBiolChem，2001，276(31)：29251-29256.

[14] Kinnula V L，Everitt J I，Whorton A R，etal. Hydrogen peroxide production by alveolar type II cells，alveolar macrophages，and endothelial cells[J].AmJPhysiol，1991，261(2Pt1)：L84-L91.

[15] Mügge A，Elwell J H，Peterson T E，etal. Release of intact endothelium-derived relaxing factor depends on endothelial superoxide dismutase activity[J].AmJPhysiol，1991，260(2Pt1)：C219-C225.