楊陽，劉少靜，楊光華，趙長琦

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021;2.北京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100875)

喜鹽鳶尾(Iris halophila Pall.)又名喜堿鳶尾、厚葉馬藺、堿地馬藺，為鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬(Iris)植物。藍(lán)花喜鹽鳶尾(Iris halophila Pall.var.sogdiana (Bge.)Grubov)是喜鹽鳶尾的變種，產(chǎn)甘肅、新疆。喜鹽鳶尾是新疆地區(qū)的傳統(tǒng)民間藥物，具有重要的藥用價(jià)值。其根狀莖、花、種子均可入藥，具有清熱解毒、利尿、通淋、止血的功效［1］。它的根狀莖入藥便是維吾爾族醫(yī)藥“鳶尾根”［2］。筆者首次對藍(lán)花喜鹽鳶尾的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從其根莖中分離得到了7 個(gè)化合物，主要為異黃酮類［3］，文獻(xiàn)報(bào)道該類化合物具有一定的藥理作用［4］。本實(shí)驗(yàn)建立了簡單、快速的HPLC 方法，用于藍(lán)花喜鹽鳶尾中1 個(gè)全新的異黃酮糖苷(圖1)的含量測定［5-6］，為開發(fā)利用該藥用植物資源，保證藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

對照品鳶尾甲黃素B 4＇-O-β-D-葡萄糖苷為自制，其結(jié)構(gòu)經(jīng)MS、NMR 確認(rèn)，經(jīng)HPLC 測定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在98%以上。實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水;甲醇為色譜純;冰醋酸為分析純;植物材料采自新疆阿克蘇地區(qū)，經(jīng)北京師范大學(xué)劉全儒教授鑒定為鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬(Iris)藍(lán)花喜鹽鳶尾(Iris halophila Pall.var.sogdiana (Bge.)Grubov)。

Aglilent-1260 系列高效液相色譜系統(tǒng)(包括四元梯度泵，50 μL 微量進(jìn)樣器，柱溫箱和DAD 二極管陣列檢測器);FA1004B 電子天平。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取該異黃酮糖苷標(biāo)準(zhǔn)品0.008 6 g，用甲醇溶解后定容至25 mL 容量瓶中，制得鳶尾甲黃素B 4＇-O-β-D-葡萄糖苷濃度為344 μg/mL 的對照品母液。用微孔濾膜(0.45 μm)濾過后放置，待用。精密吸取一定量母液，加甲醇定容配制成系列濃度的對照品溶液，其中鳶尾甲黃素B 4＇-O-β-D-葡萄糖苷濃度分別為:17.2，34.4，68.8，103.2，137.6，172 μg/mL，4 ℃冷藏備用。

圖1 鳶尾甲黃素B 4＇-O-β-D-葡萄糖苷Fig.1 Iristectorigenin B 4＇-O-β-D-glucopyranoside

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取藍(lán)花喜鹽鳶尾根莖干燥細(xì)粉(60 目)600 mg，加80% 甲醇水20 mL，索氏提取1 h，濾過洗滌，合并濾液及洗滌液至25 mL 量瓶中，甲醇定容，作為供試品溶液。用微孔濾膜(0.45 μm)濾過后放置，4 ℃冷藏備用。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為Agilent 1260HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫為室溫;體積流量為0.9 mL/min;檢測波長為268 nm;進(jìn)樣量為20 μL;流動(dòng)相為甲醇(A)-1%冰醋酸(B);梯度洗脫順序見表1。在上述色譜條件下得到的對照品及樣品的色譜圖見圖2。

表1 流動(dòng)相梯度系統(tǒng)Table 1 Mobile phase gradient system

圖2 鳶尾甲黃素B 4＇-O-β-D-葡萄糖苷對照品(A)和藍(lán)花喜鹽鳶尾藥材(B)色譜圖Fig.2 The representative HPLC iristectorigenin B 4＇-O-β-D-glucopyranoside standard(A)and 80%methanol extract of Iris halophila var.sogdiana (B)

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 線性關(guān)系觀察 精密吸取系列對照品溶液各20 μL，記錄峰面積，以峰面積積分值(Y)對質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為Y =42.025X－269.11 (R2=0.999 4)，且質(zhì)量濃度在17.2 ～172 μg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對照品溶液20 μL，按照“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，計(jì)算出峰面積積分值RSD 為2.2%。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

1.2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取藍(lán)花喜鹽鳶尾根莖粉末(60 目)600 mg，共6 份，按“1.2.2”項(xiàng)方法制備，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線，以外標(biāo)法計(jì)算鳶尾甲黃素B 4＇-O-β-D-葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為1.0%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

1.2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液20 μL，分別于0，2，4，8，12，24 h 進(jìn)樣測定，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果峰面積的RSD 為1.7%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已測定的藍(lán)花喜鹽鳶尾根莖粉末(60 目)600 mg，共6 份，每2份加入相同質(zhì)量的對照品(分別為樣品含量1/2 的25%，50%，75%)，按“1.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，依法測定。計(jì)算加樣回收率為99.78%，RSD 為0.76%。具體見表2。

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 Recoveries result of samples added(n=6)

1.3 樣品含量測定

分別精密稱取6 個(gè)批次藍(lán)花喜鹽鳶尾根莖粉末(60 目)600 mg，按“1.2.2”項(xiàng)方法制備，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線，以外標(biāo)法計(jì)算，鳶尾甲黃素B 4＇-O-β-D-葡萄糖苷的含量見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果(n=3)Table 3 Results of content determination of sample (n=3)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的優(yōu)化 黃酮類結(jié)構(gòu)中常帶有酚羥基，為了抑制其解離，克服分離時(shí)的拖尾現(xiàn)象，流動(dòng)相中需要加入酸調(diào)節(jié)pH 值。本實(shí)驗(yàn)對甲醇-0.1%乙酸，甲醇-0.5%乙酸，甲醇-1%乙酸，甲醇-2%乙酸4 種流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行比較，最終確定甲醇-1%乙酸作為流動(dòng)相。

綜合考慮分離度，出峰時(shí)間及峰形等因素，調(diào)節(jié)流動(dòng)相配比，最終采用如表1 所示的梯度進(jìn)行洗脫，可快速，準(zhǔn)確地測定藍(lán)花喜鹽鳶尾中鳶尾甲黃素B 4＇-O-β-D-葡萄糖苷的含量。

2.1.2 檢測波長的選擇 依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了230，245，254，268，290，295，310，355 nm等8 個(gè)波長進(jìn)行考察，利用DAD 檢測器掃描這些波長下鳶尾甲黃素B 4＇-O-β-D-葡萄糖苷的吸收光譜。結(jié)果表明，其在268 nm 波長處有最大吸收，且噪音較小，基線平滑，具有較高的靈敏度，故選擇268 nm作為檢測波長。

2.2 樣品提取工藝的考察

以鳶尾甲黃素B 4＇-O-β-D-葡萄糖苷的提取率為指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇，90%甲醇水，80%甲醇水，70%甲醇水等幾種不同比例的提取溶劑對提取效率的影響。結(jié)果表明，80%甲醇水的提取率最高且峰形良好。同時(shí)考察了提取時(shí)間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果為索式提取1 h 即可提取完全。

3 結(jié)論

鳶尾屬植物最重要的化學(xué)成分是異黃酮類，研究證實(shí)鳶尾屬的異黃酮類成分具有抗癌、抑菌、抗氧化、保護(hù)肝臟及心血管系統(tǒng)等廣泛的藥理活性，是評價(jià)鳶尾屬藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。HPLC 分析結(jié)果表明，鳶尾甲黃素B 4＇-O-β-D-葡萄糖苷是藍(lán)花喜鹽鳶尾藥材中一種高含量的異黃酮類成分，具有一定代表性;并且目前還沒有關(guān)于藍(lán)花喜鹽鳶尾中異黃酮類含量測定的報(bào)道，本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為藥材的質(zhì)量控制和后續(xù)開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

［1］ 江紀(jì)武.藥用植物辭典［M］.天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社，2005:420.

［2］ 劉勇民.維吾爾藥志:上冊［J］.烏魯木齊:新疆人民出版社，1986:258.

［3］ 楊陽，陳潔君，趙長琦.膜苞鳶尾和藍(lán)花喜鹽鳶尾的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2013，44(11):1371-1375.

［4］ Wang Hui，Cui Yanmei，Zhao Changqi.Flavonoids of the Genus Iris (Iridaceae)［J］.Mini-Reviews in Medicinal Chemistry，2010(10):643-661.

［5］ 湯毅，廖祎婷，袁月梅，等.HPLC 法測定葛花中鳶尾苷的含量［J］.中國野生植物資源，2009，28(5):45-47.

［6］ 王笳，袁崇均，游宇光，等.HPLC 法測定川射干中鳶尾黃酮苷的含量［J］.中國藥房，2008，19(6):440-442.