葉 婷 寧 勇

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，湖北武漢 430030；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北武漢 430030

衰老是增齡過程中不可避免的結(jié)果，往往帶來多個器官功能受損。 腎臟是一個血供極其豐富的器官，在衰老過程中腎臟表現(xiàn)最為明顯。氧化損傷在人體衰老中發(fā)揮著重要作用。過氧化物酶增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）屬核激素受體超家族成員，除了具有調(diào)解脂質(zhì)和糖代謝、抗炎調(diào)解免疫等重要生理功能，近來還發(fā)現(xiàn)其在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)方面具有重要意義。核因子E2 相關(guān)因子-2（nuclear factor-E2-related factor-2，Nrf2）是新近發(fā)現(xiàn)的又一個在氧化應(yīng)激中起核心作用的轉(zhuǎn)錄激活因子。兩者是否也在腎臟衰老中發(fā)揮作用鮮有報道。 本文擬探討PPARγ 和Nrf2 在腎臟衰老氧化損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及標(biāo)本留取

選擇SD 雄性大鼠（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供）20 只，常規(guī)條件下于實(shí)驗(yàn)動物中心分籠飼養(yǎng)，保持12 h 的晝夜循環(huán)，室溫控制在23℃左右，濕度維持在40%～50%，自由進(jìn)食水。將10 只大鼠飼養(yǎng)至3 個月齡（相當(dāng)于成人20 歲）作為青年組，10 只大鼠飼養(yǎng)至24 個月齡（相當(dāng)于成人80 歲以上）作為衰老組。斷頭處死放血干凈，生理鹽水沖洗腎臟。一側(cè)腎臟迅速縱切分割后，一半置于液氮保存，隨后-80℃保存留待蛋白質(zhì)檢測中使用，一半留作病理檢查；對側(cè)腎臟立即制備組織勻漿。

1.2 方法

1.2.1 腎臟組織病理學(xué)分析 腎臟組織石蠟切片（2～3 μm）常規(guī)脫蠟入水，行PAS 染色，普通光鏡下觀察腎臟組織病理改變。

1.2.2 腎臟組織過氧化氫（H2O2）含量測定 腎臟組織勻漿按照H2O2檢測試劑盒（BioAssay System's peroxide assay kit，Hayward，CA））說明書進(jìn)行。

1.2.3 腎臟組織丙二醛（MDA）測定 腎臟組織MDA 測定采用硫代巴比妥酸法（TBARS）檢測試劑盒（Cat#10009055，Ann Arbor，MI），操作參照說明書進(jìn)行。

1.2.4 Western Blot 法 Western Blot 法檢測髓過氧化物酶（MPO）、Nrf2、PPARγ 的蛋白表達(dá)水平。分別提取總蛋白和核蛋白，操作參照說明書進(jìn)行（T-PER?Tissue Protein Extraction Reagent 和NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents，Thermo Scientific）。 各組分別取總蛋白或核蛋白20 μg，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后電轉(zhuǎn)移至0.22 μm PVDF 膜上。 5%的BSA 封閉1 h，用MPO（Abcam，ab22604，1∶5000）、Nrf2（Abcam，ab81445，1∶2000）和PPARγ（Santa Cruz，sc-25591，1∶2000）一抗4℃孵育過夜，用TBST 振搖洗膜10 min×3 次，以1∶5000 稀釋的羊抗兔生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h后，再次用TBST 振搖洗膜10 min×3 次。 ECL 底物化學(xué)發(fā)光（Supersignal West Dura Kit，Thermo Scientific）顯色后機(jī)器掃描存盤，以Scion Image 軟件進(jìn)行條帶分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.50 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織病理學(xué)改變

衰老組可見腎小管基底膜增厚皺縮，小管上皮細(xì)胞水腫、變性、壞死，部分小管囊狀擴(kuò)張、萎縮，局灶性小管消失，間質(zhì)增寬，炎癥細(xì)胞浸潤。病變嚴(yán)重區(qū)域可見系膜增生，節(jié)段性腎小球硬化。 見圖1。

圖1 腎臟組織病理改變（PAS×400）

2.2 腎臟組織H2O2、MDA 含量及MPO 蛋白表達(dá)情況

衰老組腎臟組織H2O2含量較青年組明顯升高[（239.90±39.38）μmol/μg 比（110.00±19.49）μmol/μg]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 衰老組腎臟組織MDA 含量較青年組亦明顯升高[（44.42±4.17）μmol/mg 比（26.23±1.43）μmol/mg]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與青年組相比，衰老組腎臟組織MPO 蛋白表達(dá)明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。 見圖2。

圖2 腎臟組織氧化損傷指標(biāo)檢測

2.3 腎臟組織Nrf2、PPARγ 蛋白表達(dá)

與青年組相比，衰老組腎臟組織Nrf2 蛋白表達(dá)無顯著性改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；而PPARγ表達(dá)則明顯下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖3。

圖3 腎臟組織Nrf2、PPARγ 蛋白表達(dá)情況

3 討論

中國將是一個不可逆轉(zhuǎn)的老齡社會，伴隨老齡化的進(jìn)程，慢性腎臟病逐年遞增。 老年腎臟病的有效防治已成為關(guān)系到我國民生的重要公共衛(wèi)生問題。腎臟是衰老過程中人體器官變化最為明顯的器官之一，正常人在超過40 歲后腎小球?yàn)V過率平均每年下降1%，形態(tài)上表現(xiàn)為體積和重量下降，皮質(zhì)相對萎縮、腎小球硬化等[1]。衰老是一個極為復(fù)雜的過程，受多種因素調(diào)控。 目前關(guān)于衰老的理論主要有自由基學(xué)說、線粒體DNA 損傷學(xué)說、端粒學(xué)說和衰老的基因?qū)W說等。早在1955 年，Harman 發(fā)表的“衰老的自由基理論”就提出，體內(nèi)產(chǎn)生過多自由基是引起衰老的重要因素[2]。伴隨增齡，機(jī)體抗氧化防御酶體系清除自由基的能力下降，導(dǎo)致體內(nèi)的自由基代謝紊亂。 自由基對機(jī)體組織細(xì)胞的損傷累積增加，最終導(dǎo)致組織器官形態(tài)機(jī)能老化，從而促使機(jī)體的衰老。

本研究采用24 個月齡衰老大鼠作為研究對象，比通常使用D-半乳糖造模更能真實(shí)反映衰老變化及其機(jī)制。 本研究發(fā)現(xiàn)，衰老組腎臟組織H2O2及MDA含量明顯增加，提示腎臟氧自由基的產(chǎn)生明顯增加。同時衰老組腎臟組織MPO 蛋白質(zhì)表達(dá)也明顯升高，MPO 能催化反應(yīng)生成過量的包括次氯酸在內(nèi)的氧化劑。 這些均提示氧化損傷參與了腎臟衰老的發(fā)生，與以往（D-半乳糖造模）研究一致。

PPARγ 屬Ⅱ型核激素受體超家族成員，作為一種核受體，與所調(diào)控目的基因上游啟動子區(qū)的過氧化物酶增殖物反應(yīng)元件（PPRE）結(jié)合后發(fā)揮對目的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)和糖代謝，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎等功能。 PPARγ 還在維持機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用[3-4]。在腎臟缺血再灌注大鼠模型中，PPARγ 激動劑匹格列酮能緩解彌漫性腎小管壞死和急性炎性反應(yīng)，上調(diào)SOD1 表達(dá)，而下調(diào)p47phox和p67phox[5]。 在慶大霉素和順鉑導(dǎo)致的腎損傷中，PPARγ 激動劑均能上調(diào)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等抗氧化酶的表達(dá)，減少自由基產(chǎn)生，提高機(jī)體抗氧化能力，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[6-7]。 在高同型半胱氨酸誘導(dǎo)血管性癡呆大鼠模型中，PPARγ 激動劑可以改善學(xué)習(xí)、記憶功能，提高大腦中GSH 水平，減少自由基產(chǎn)生[8]。在體外衰老模型人二倍體成纖維細(xì)胞中，PPARγ 表達(dá)明顯下降。 而給予PPARγ 激動劑則能通過調(diào)節(jié)ERK1/2 通路減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS 產(chǎn)生， 抑制ICAM-1、MMP-2、MMP-9 等炎癥因子表達(dá)[9]。 PPARγ調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的機(jī)制，一方面是對NF-κB 的抑制作用，另一方面是PPARγ 對機(jī)體抗氧化酶表達(dá)的直接調(diào)節(jié)作用。 以CAT 為代表的一些抗氧化酶的啟動子區(qū)具有PPRE，PPARγ 可以直接結(jié)合PPRE，誘導(dǎo)抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄與翻譯[10]。 在本研究中發(fā)現(xiàn)，衰老組大鼠腎臟組織中PPARγ 表達(dá)明顯下調(diào)，因此可能導(dǎo)致其靶目標(biāo)的抗氧化酶隨之表達(dá)不足，導(dǎo)致機(jī)體清除自由基的防御能力下降，從而導(dǎo)致腎臟衰老發(fā)生。

Nrf2 是新近發(fā)現(xiàn)的在氧化應(yīng)激中起核心作用的轉(zhuǎn)錄激活因子，當(dāng)受到來源于活性氧或親核劑的信號攻擊后，Nrf2 與其胞漿抑制蛋白Keap1 解離，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）結(jié)合，并介導(dǎo)主要抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶，如NAD（P）H：醌氧化還原酶（NQO1）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、GPx、谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）和血紅素氧化酶（HO-1）等基因的轉(zhuǎn)錄活性。而抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶是機(jī)體清除自由基及內(nèi)源性和外源性有害物質(zhì)最主要的酶促系統(tǒng)。 因此，Nrf2 對于維持機(jī)體氧化還原平衡，應(yīng)對氧化應(yīng)激有關(guān)鍵性作用[11-12]。在衰老血管中，Nrf2 和SOD 表達(dá)下調(diào)同時，伴隨著輕度的炎癥狀態(tài)和血管舒張功能不全[13]。 在衰老小鼠的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，給予氧化刺激后細(xì)胞Nrf2 不能保護(hù)性上調(diào)，從而導(dǎo)致多種抗氧化酶水平也不能隨之升高，細(xì)胞清除自由基功能下降[14]。 但在本研究中，衰老大鼠腎臟組織中Nrf2 表達(dá)無明顯變化。 提示腎臟衰老過程中抗氧化能力的減退并不是由Nrf2 通路介導(dǎo)。

本研究再次證實(shí)自由基過度產(chǎn)生所導(dǎo)致的氧化損傷在腎臟衰老中具有重要意義，而抗氧化防御系統(tǒng)功能減退可能由PPARγ 通路介導(dǎo)，而不是由Nrf2 通路介導(dǎo)，其具體的機(jī)制與作用還需進(jìn)一步深入探討。

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