馬瑞麗， 李 敏， 徐秀泉， 王云麗， 湯 建*， 陳海生

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2.上海第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院， 上海 200433)

尾葉香茶菜Rabdosiaexcisa(Maxim.)Hara，又名龜葉草、狗日草、野蘇子，為唇形科香茶菜屬植物，多產(chǎn)于我國(guó)東北及朝鮮的山區(qū)。性涼味甘，民間用于治療胃炎，膀胱脹痛，癌癥，感冒發(fā)熱等[1-2]。尾葉香茶菜二萜類(lèi)成分具有良好的抗癌、抑制酪氨酸酶、抗氧化等活性[3-5]，其中主要成分尾葉香茶菜丙素(kamebakaurin, KA) 因其顯著的抗炎免疫、神經(jīng)保護(hù)和抗腫瘤活性而備受關(guān)注[6-8]。但目前尾葉香茶菜丙素及結(jié)構(gòu)類(lèi)似物主要通過(guò)植物提取方法制得，且藥材中二萜類(lèi)化合物種類(lèi)多而含有量不高[4, 9]，因此，選取一條高效制備總二萜的工藝對(duì)于尾葉香茶菜丙素等二萜化合物的結(jié)構(gòu)改造、活性篩選以及作用機(jī)制等深入研究至關(guān)重要。

大孔吸附樹(shù)脂是上世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的分離技術(shù)，因其理化性質(zhì)穩(wěn)定，分離純化有效成分性能優(yōu)異，在中藥生產(chǎn)過(guò)程中使用廣泛[10-11]。目前已有利用AB-8、D101等大孔吸附樹(shù)脂富集、純化二萜類(lèi)成分的報(bào)道[5, 12]，但在前期研究中發(fā)現(xiàn)，以尾葉香茶菜地上部分為原料制備總二萜，提取物中雜質(zhì)較多，含有大量的色素，影響到總二萜的活性評(píng)價(jià)和化合物的分離純化。本實(shí)驗(yàn)考察不同大孔樹(shù)脂、不同吸附、解析條件等工藝參數(shù)，優(yōu)化制備尾葉香茶菜總二萜的流程，以期建立規(guī)模化制備尾葉香茶菜總二萜的生產(chǎn)工藝。

1 儀器與材料

R-21旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI)，LC-20A高效液相色譜儀(SHIMADZU)；ZF-300超聲波清洗機(jī)；Sartorius電子天平；PCS型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；液相用色譜純甲醇，雙純水；樹(shù)脂柱洗脫用去離子水和90%乙醇。HPD400和HPD826(滄州寶恩)，AB-8和D101樹(shù)脂(天津南開(kāi))，HP 20(日本三菱)，XAD16N和XAD7HP (上海陶氏化學(xué))。

藥材采自吉林長(zhǎng)白山區(qū)，經(jīng)本院歐陽(yáng)臻教授鑒定為尾葉香茶菜Rabdosiaexcisa(Maxim.)Hara。尾葉香茶菜丙素(KA)對(duì)照品由本室自制，經(jīng)面積歸一化法檢測(cè)純度98.6%，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法

2.1.1 HPLC測(cè)定尾葉香茶菜丙素 精密稱(chēng)取干燥的尾葉香茶菜丙素10.02 mg置于50 mL量瓶，用95%乙醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。將原液依次稀釋成100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的梯度濃度溶液，分別取上述對(duì)照品溶液20 μL進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=14 079X+4 938.3，r2=0.999 9，在3.125～100.0 μg/mL間呈良好線性關(guān)系[13]。

Inertsil ODS-SP柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫25 ℃；流動(dòng)相為甲醇-水(等度洗脫，50∶50)；體積流量0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm。對(duì)照品及樣品依上述條件檢測(cè)，HPLC圖如圖1。

圖1 尾葉香茶菜丙素(KA)對(duì)照品(A)(0.05 mg/mL)和樣品(B)(1.0 mg/mL)HPLC圖

2.1.2 UV法測(cè)定總二萜的量 分別精密吸取對(duì)照品溶液(0.5 mg/mL) 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL至量瓶中，定容至10 mL，在最大吸收波長(zhǎng)235 nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=44.039X-0.698 7，r=0.999 7，在5.0～30.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 藥材吸附液的制備 尾葉香茶菜75%甲醇提取物浸膏，先用少量乙醇溶解，再加熱水，配置所需濃度的吸附溶液。

2.3 樹(shù)脂的篩選

2.3.1 靜態(tài)吸附試驗(yàn) 精密稱(chēng)取預(yù)處理過(guò)的大孔樹(shù)脂1.0 g，分別加入20 mL吸附液，搖床振搖24 h，使充分吸附。紫外和HPLC兩種檢測(cè)方法，計(jì)算各種樹(shù)脂吸附量。7種樹(shù)脂的吸附量如表1。

表1 不同樹(shù)脂對(duì)總二萜和尾葉香茶菜丙素的靜態(tài)吸附量及解析率(n=3)

2.3.2 靜態(tài)解析試驗(yàn) D101、HP20和XAD16N 3種樹(shù)脂各3份(1.0 g)至于錐形瓶中，加入20 mL 1.0 mg/mL提取液使其振蕩24 h，充分吸收后將液體抽濾，向其中各加入20 mL 70%、80%、90%、95% 乙醇，振搖24 h，使其充分解析。發(fā)現(xiàn)3種樹(shù)脂都是95%乙醇解析率最高。故選用95%的乙醇考察7種樹(shù)脂的靜態(tài)解析率。上述7種樹(shù)脂充分吸收樣品后將液體抽濾，樹(shù)脂分別加入20 mL 95%乙醇，振搖24 h，使其充分解吸。7種樹(shù)脂的解析率見(jiàn)表1。

根據(jù)表1可知，XAD16N、HP20和HPD826樹(shù)脂具有較高的吸附率，但HPD826樹(shù)脂對(duì)總二萜的解析率較低，對(duì)尾葉香茶菜丙素的解析率也低于XAD16N和HP20樹(shù)脂。綜合考慮，選用XAD16N和HP20樹(shù)脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附劑解析試驗(yàn)。

2.3.3 動(dòng)態(tài)吸附及解析試驗(yàn) XAD16N和HP20樹(shù)脂各取25 g(約50 mL)，置于玻璃柱中(Φ 20 mm)。取50 mL質(zhì)量濃度為10 mg/mL吸附液 (為提高其濃度，加熱至60 ℃) 加于柱頂，流出液再上柱重新吸附，靜置12 h后用水洗脫3 BV，再改用95%乙醇洗至無(wú)二萜類(lèi)化合物流出。XAD16N樹(shù)脂和HP 20樹(shù)脂對(duì)總二萜和尾葉香茶菜丙素的動(dòng)態(tài)吸附量和解析率見(jiàn)表2?？紤]技術(shù)及經(jīng)濟(jì)因素，選用XAD16N樹(shù)脂經(jīng)行尾葉香茶菜總二萜制備的工藝研究。

表2 兩種樹(shù)脂對(duì)總二萜和尾葉香茶菜丙素的動(dòng)態(tài)吸附量及解析率(n=3)

2.4 XAD16N樹(shù)脂純化總二萜的工藝優(yōu)化

2.4.1 吸附液質(zhì)量濃度的考察 將質(zhì)量濃度為25 mg/mL(70 ℃)的提取液分別在60 ℃下稀釋至10、5、2.5、1.25 mg/mL。5種質(zhì)量濃度的吸附液以2 BV/h的體積流量進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，用5 BV水以同樣體積流量洗脫，再以95%乙醇以2 BV/h的體積流量洗脫，收集洗脫液，測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算吸附率(圖2)。

圖2 吸附液質(zhì)量濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附率的影響

從圖2可以看出，若質(zhì)量濃度較低，目標(biāo)成分吸附較慢，部分化合物隨液體流出；若吸附質(zhì)量液濃度太大總二萜吸附率也不高，可能是因?yàn)橘|(zhì)量濃度偏高而化合物傳輸受阻，且局部過(guò)載，部分化合物隨洗脫液流出。因此，吸附液質(zhì)量濃度選擇10 mg/mL。

2.4.2 動(dòng)態(tài)吸附泄漏曲線 XAD16N樹(shù)脂25 g(約50 mL)，置于玻璃柱中(Φ 20 mm)。取100 mL質(zhì)量濃度為10 mg/mL(60 ℃)吸附液加于柱頂，以2 BV/h的體積流量進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，流出液每10 mL收集一次，測(cè)其紫外吸光度和尾葉香茶菜丙素量，以收集液體積為橫坐標(biāo)，流出液中未吸附化合物比率為縱坐標(biāo)繪制泄漏曲線(圖3)。XAD16N樹(shù)脂的總二萜和尾葉香茶菜丙素泄漏曲線趨勢(shì)相似，尾葉香茶菜丙素在50 mL以前吸附率略高于總二萜類(lèi)化合物，50 mL后吸附率略低于總二萜類(lèi)成分，且70 mL后基本不再吸附，而總二萜類(lèi)組分是80 mL后達(dá)到吸附飽和狀態(tài)。

圖3 XAD16N樹(shù)脂的泄漏曲線

2.4.3 吸附體積流量的考察 3份XAD16N樹(shù)脂25 g(約50 mL)，分別置于玻璃柱中(Φ 20 mm)。以不同的體積流量加入10 mg/mL吸附液(60 ℃)50 mL：1、2、4 BV/h。其總二萜吸附量分別是 7.9、7.6和6.6 mg/g，KA吸附量分別是2.2、2.2和2.0 mg/g。綜合考慮吸附率和時(shí)間成本，選用2 BV/h流量。

2.4.4 洗脫用水pH的考察[14]吸附液上樣到XAD16N樹(shù)脂，其完全吸附后分別用pH為7、8、9、10的NaOH水溶液及pH為9的10%的乙醇進(jìn)行洗脫，除去色素。洗至無(wú)色后用95%乙醇洗下目標(biāo)組分，濃縮后配置成原來(lái)體積，在250 nm測(cè)其A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)公式：脫色率(%)=(A前-A后)/A前計(jì)算脫色率，A前為脫色前溶液在最大吸收波長(zhǎng)330 nm處的A值，A后為脫色后溶液在最大吸收波長(zhǎng)250 nm處A值。pH對(duì)脫色率的影響見(jiàn)圖4。雖然pH為9的15%乙醇脫色率高于pH 9的水溶液，但易洗脫出二萜化合物，故選擇pH 9的堿水脫色。

圖4 洗脫劑pH對(duì)解析率的影響

2.4.5 洗脫劑體積流量考察 取“2.4.3”項(xiàng)中的3份樣品，先以pH 9的NaOH水溶液洗至洗脫液顏色不再變淺，再用2 BV 95%乙醇分別在2、4、6 BV/h流量下洗脫。解析度分別為98% (KA: 99%)、95% (KA: 96%)和86%(KA: 88%)。綜合考慮洗脫時(shí)間、試劑和解析率，選用4 BV/h體積流量考察動(dòng)態(tài)解析曲線。

2.4.6 動(dòng)態(tài)解析曲線考察 最優(yōu)動(dòng)態(tài)吸附條件上柱，充分吸收后用pH 9的NaOH水溶液洗至洗脫液顏色不再變淺，再用95%乙醇分別在4 BV/h流量下洗脫。每10 mL收集一次洗脫液，測(cè)定吸光度，繪制樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)解吸曲線。見(jiàn)圖5。洗脫液用量為4 BV時(shí)，能夠基本解析全部總二萜類(lèi)成分。

圖5 動(dòng)態(tài)解析曲線

2.5 工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)表明XAD16N樹(shù)脂制備尾葉香茶菜總二萜的最優(yōu)工藝條件是吸附溶液質(zhì)量濃度為10 mg/mL(60 ℃)，吸附液與樹(shù)脂的比例2∶1(V/m)，吸附流量2 BV/h，脫色時(shí)水pH 9，95%乙醇解析體積流量4 BV/h，用量4 BV。采用最優(yōu)工藝條件進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)3次。

所得結(jié)果見(jiàn)表3，XAD16N樹(shù)脂制備尾葉香茶菜二萜具有良好的穩(wěn)定性。所得樣品經(jīng)參照“2.1.2”項(xiàng)條件HPLC分析，與圖1相比，尾葉香茶菜丙素明顯得到富集，見(jiàn)圖6。

表3 工藝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 產(chǎn)品中尾葉香茶菜丙素(KA)HPLC圖譜

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)7種不同大孔吸附樹(shù)脂純化尾葉香茶菜總二萜的性能進(jìn)行了研究，綜合考慮技術(shù)及經(jīng)濟(jì)因素，選擇XAD16N樹(shù)脂用于制備尾葉香茶菜總二萜的工藝研究。針對(duì)XAD16N大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行了吸附、解析以及脫色工藝條件的優(yōu)化，在優(yōu)選條件下，通過(guò)XAD16N樹(shù)脂制得的產(chǎn)品中二萜類(lèi)成分的量為52%，其中尾葉香茶菜丙素(KA)的量為8.8%，約為藥材中的100倍。該工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定，純化效果好，成本較低，具有規(guī)模化應(yīng)用價(jià)值，為后續(xù)制備較高純度尾葉香茶菜總二萜和精制尾葉香茶菜丙素打下了重要基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委會(huì). 中國(guó)植物志[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1977, 65: 490.

[2] 嚴(yán)仲鎧, 李萬(wàn)林. 中國(guó)長(zhǎng)白山藥用植物彩色圖志[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1996， 551.

[3] 樸 艷. 長(zhǎng)白山區(qū)尾葉香茶菜活性成分的化學(xué)研究[D]. 延吉: 延邊大學(xué), 2011.

[4] 吳月霞. 尾葉香茶菜花和果實(shí)化學(xué)成分的研究[D]. 鄭州: 鄭州大學(xué), 2012.

[5] 桂明玉, 金永日, 李緒文. 一種新的天然藥物有效部位-尾葉香茶菜總二萜: 中國(guó), 03145532.8[P]. 2007-10-31.

[6] Lee J H, Choi J K, Noh M S,etal. Anti-inflammatory effect of kamebakaurin ininvivoanimal models[J].PlantaMed, 2004, 70(6): 526-530.

[7] Paris D, Patel N, Quadros A,etal. Inhibition of Aβ production by NF-κB inhibitors[J].NeurosciLett, 2007, 415(1): 11-16.

[8] Gui M Y, Aoyagi Y, Jin Y R,etal. Excisanin H, a novel cytotoxic 14, 20-epoxy-ent-kaurene diterpenoid, and three new ent-kaurene diterpenoids fromRabdosiaexcisa[J].JNatProd, 2004, 67(3): 373-376.

[9] 桂明玉, 李緒文, 王寶珍, 等. RP-HPLC法測(cè)定不同生長(zhǎng)期尾葉香茶菜中二萜類(lèi)成分的含量[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版, 2007, 45(1): 125-127.

[10] 雷 雪, 劉富崗, 楊 云. 大孔吸附樹(shù)脂純化貫葉連翹提取物的工藝[J]. 中成藥, 2012, 34(9): 1696-1699.

[11] 陳隨清, 陳磊磊, 魏雅磊, 等. 大孔吸附樹(shù)脂純化山橿總黃酮的工藝研究[J]. 中成藥, 2013, 35(2): 272-277.

[12] 張崇禧. 尾葉香茶菜中萼西香茶菜甲素的制備新工藝: 中國(guó), 200810100251.1[P]. 2010-06-09.

[13] 湯 建, 陳 微, 劉書(shū)芳, 等. 尾葉香茶菜各部位中kamebakaurin含量測(cè)定[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2012, 23(5): 1181-1182.

[14] 趙全成, 赫玉芳, 南敏倫, 等. 尾葉香茶菜總二萜的制備新方法：中國(guó), 201010262110.7[P]. 2010-08-25.