王雅娟， 朱慧志， 孔獻(xiàn)春， 鹿 林， 劉 璐， 張 玉， 李澤庚*

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230038)

支氣管哮喘(bronchial asthma,簡稱哮喘)是常見的慢性呼吸道疾病之一, 近年來其患病率在全球范圍內(nèi)有逐年增加的趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。支氣管哮喘屬祖國醫(yī)學(xué)“哮病”、“呷嗽”等范疇，病因?yàn)橥庑扒忠u、痰濁阻肺、肺腎虧虛所致。多部古書中均指出瘀亦與痰在哮病病理過程中并存。痰可致瘀，痰也可因瘀而生。哮病夙根當(dāng)為痰、瘀、虛三者。臨床治療包括從脾、肺、腎、肝論治或從痰飲、瘀血論治[2-3]。

傘形科植物川芎是歷史悠久的活血化瘀中藥，味辛性溫，功能為活血化瘀、行氣開郁、祛風(fēng)止痛?！侗静菥V目》謂其為“血中氣藥”。川芎嗪(ligustrazine, LTZ)是由川芎中提取的2，3，5，6-四甲基吡嗪，簡稱四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TMP)。中藥川芎在治療哮喘的臨床應(yīng)用上已有20多年，已證實(shí)其對哮喘有輔助治療作用，而川芎嗪也常常用做臨床上治療哮喘的輔助用藥[4-6]。已有研究證實(shí)川芎嗪對哮喘動物模型具有一定的治療作用并能夠調(diào)節(jié)p38蛋白激酶、抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流、降低血清和支氣管肺泡灌洗液中的TNF-a水平，具有糖皮質(zhì)激素樣抗炎作用及抗氣道重塑的作用[7-9]。但關(guān)于川芎嗪對哮喘大鼠的肺功能及氣道高反應(yīng)性的改善作用至今未見報道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察川芎嗪對哮喘大鼠的肺功能及氣道高反應(yīng)性的影響，以及對相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響，以驗(yàn)證川芎嗪對支氣管哮喘的治療效果，并初步探討其機(jī)制，為進(jìn)一步有效防治哮喘病，開發(fā)川芎嗪的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 卵白蛋白(Ovalbumin，OVA，V級，美國Sigma產(chǎn)品)；氨甲酰膽堿(Methacholine, Mch, Sigma公司，批號79H1505)；注射用鹽酸川芎嗪(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，批號111103A2)；地塞米松磷酸鈉注射液(蕪湖康奇制藥有限公司，批號120211)，其余均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 Sprague-Dawley大鼠，清潔級，雄性，體質(zhì)量160～180 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物合格證號：Scxk(滬)2008-0016。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 霧化吸入器(980型，上海新天緣醫(yī)療設(shè)備有限公司)；動物肺功能儀(V5.0，南京美易公司)；磁力攪拌器(JB-4，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；顯微鏡(Olympus BX51, Germany)；TGL-18R冷凍離心機(jī)(黑馬儀器公司)；低速離心機(jī)(上海飛鴿離心機(jī)TDL-40B)；可調(diào)式移液器(Eppendorf可調(diào)式移液器)；低速離心機(jī)(型號SC-3610 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 哮喘模型的制備與實(shí)驗(yàn)給藥 大鼠分為正常對照組、哮喘模型組、川芎嗪高劑量組、川芎嗪低劑量組、地塞米松組，每組15只。哮喘模型采用以0.2%的OVA(Grade V)凝膠十點(diǎn)致敏，并以1%的OVA生理鹽水溶液霧化攻擊復(fù)制，用新鮮配制的10%氫氧化鋁凝膠溶入OVA，OVA的終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%，對哮喘模型組和給藥組動物進(jìn)行十點(diǎn)致敏法，包括兩前后足跖4點(diǎn)，兩腹股溝2點(diǎn)，頸部1點(diǎn)，背部左、中、右3點(diǎn)，每點(diǎn)皮下注射0.05 mL 0.2%卵白蛋白凝膠，腹腔注射0.5 mL，共計(jì)1 mL/鼠[10]。致敏第14天開始用1%的OVA霧化(德國Master超聲霧化器，1～5 m partica1)吸入30 min進(jìn)行攻擊，持續(xù)7 d，同時每次攻擊前0.5 h腹腔注射給予各治療藥物，每天一次，持續(xù)7 d：川芎嗪高劑量組給予川芎嗪注射液80 mg/(kg·d)，川芎嗪低劑量組給予川芎嗪注射液40 mg/(kg·d)，地塞米松組給予地塞米松注射液0.1 mg/(kg·d)[11]。

1.4.2 大鼠Mch的氣道反應(yīng)性的測定 致敏大鼠末次攻擊24 h后將大鼠用6%水合氯醛6 mL/kg腹腔注射麻醉，行氣管插管后，置于密閉的自制身體容積描記器內(nèi)。用動物肺功能儀記錄麻醉大鼠霧化吸入Mch前后的氣道阻力(RL)和肺順應(yīng)性(Cdyn)。實(shí)驗(yàn)時吸入的Mch由超聲霧化器霧化，吸入質(zhì)量濃度依次為0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 g/L，每一質(zhì)量濃度霧化吸入20 s，間隔5～10 min后吸入下一個質(zhì)量濃度，觀察并記錄吸入后5 min內(nèi)RL和Cdyn的變化。

1.4.3 大鼠血清IgE水平的測定 大鼠股動脈取血，離心分離血清，ELISA試劑盒檢測血清IgE水平。

1.4.4 大鼠肺組織HE染色 大鼠股動脈放血處死，取肺組織，于10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，待做HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪對哮喘大鼠肺功能及氣道高反應(yīng)性的影響 肺通氣的阻力是肺通氣過程中所遇到的阻力，分為彈性阻力和非彈性阻力。彈性阻力包括肺的彈性阻力和胸廓的彈性阻力，非彈性阻力包括氣道阻力、慣性阻力和組織的黏滯阻力。本實(shí)驗(yàn)主要用動物肺功能儀記錄麻醉大鼠霧化吸入Mch前后的RL和Cdyn的變化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，分別繪制肺順應(yīng)性變化柱狀圖(圖1A)和肺阻力變化柱狀圖(圖1B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺順應(yīng)性明顯低于正常組大鼠而肺阻力明顯高于正常組大鼠(P<0.05)，且隨著Mch刺激質(zhì)量濃度的增加，肺順應(yīng)性逐漸下降，而肺阻力逐漸上升，且模型組大鼠肺功能柱狀圖變化趨勢大于其他各組，說明模型組大鼠對Mch的敏感性高于其余各組(圖1)。川芎嗪高、低劑量組均能夠明顯改善氨甲酰膽堿誘導(dǎo)的哮喘大鼠的氣道高反應(yīng)性(P<0.05)，越高質(zhì)量濃度的氨甲酰膽堿刺激改善作用越明顯，其中對肺順應(yīng)性下降的改善作用優(yōu)于對肺阻力增加的改善作用，川芎嗪高、低劑量組之間沒有明顯差異。

圖1 川芎嗪對哮喘模型大鼠甲酰膽堿刺激的氣道高反應(yīng)性的影響

2.2 川芎嗪對哮喘大鼠血清IgE水平的影響 支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，因此IgE在支氣管哮喘發(fā)病中起著關(guān)鍵作用，哮喘患者的IgE水平較正常人明顯升高，IgE的水平和炎癥、免疫等多種因素相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組大鼠的血清IgE水平較正常對照組明顯升高(P<0.01)，川芎嗪高、低劑量組均能夠一定程度的降低哮喘大鼠的IgE水平，提示其對哮喘的發(fā)生發(fā)展可能起到抑制作用，見圖2。

圖2 川芎嗪對血清IgE水平的影響

2.3 川芎嗪對肺組織炎癥細(xì)胞浸潤的影響 肺組織經(jīng)HE染色觀察病理改變，由圖3可見，正常對照組氣道壁及肺泡結(jié)構(gòu)正常，氣管黏膜上皮完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤，OVA致敏模型組可見氣道周圍及肺間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(以EOS、淋巴細(xì)胞為主)，支氣管管壁增厚、管腔狹窄，支氣管管壁及平滑肌較對照組增厚。川芎嗪高、低劑量組和模型組相比炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，支氣管管壁及平滑肌較模型組變薄，其中川芎嗪高劑量組和地塞米松組效果相當(dāng)(圖3)。

圖3 HE染色觀察川芎嗪對肺組織炎癥細(xì)胞浸潤的影響

3 討論

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究，全球約有3億患者，各國患病率不等。我國哮喘患病率呈逐年上升趨勢，且兒童患病率高于青壯年，老年人群的患病率有增高的趨勢[1]。目前認(rèn)為哮喘的發(fā)病機(jī)制涉及多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)以及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。這種慢性炎癥與氣道高反應(yīng)性相關(guān)，通常出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受限，并引起反復(fù)發(fā)作性的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀[12]。目前對哮喘的發(fā)作治療主要以糖皮質(zhì)激素聯(lián)合b2受體激動劑為主，但這些藥物并不能從根本上抑制哮喘的氣道炎癥、防止哮喘的發(fā)作且長期應(yīng)用副作用大，因此有必要尋找對哮喘的慢性炎癥及急性發(fā)作有防治作用的新藥。

川芎嗪在臨床上可用于哮喘的輔助治療，有鹽酸鹽和磷酸鹽兩種制劑，藥理研究證實(shí)其具有抗血小板聚集，使已聚集的血小板有解聚作用，擴(kuò)張血管，增加心腦血流量，改善微循環(huán)，是良好的活血行氣、祛風(fēng)止痛之藥物[13]?？赏ㄟ^增加支氣管平滑肌內(nèi)cAMP水平、抑制炎癥因子釋放、調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡等途徑對支氣管平滑肌產(chǎn)生松弛作用，從而對支氣管哮喘起到一定的治療效果，而哮喘的急性發(fā)作根源為氣道的高反應(yīng)性，目前對于川芎嗪對哮喘模型的氣道高反應(yīng)性的研究鮮見。

有研究結(jié)果表明，通過對大鼠氣道插管機(jī)械通氣測定肺氣道阻力和順應(yīng)性是測定哮喘大鼠氣道反應(yīng)性的常用指標(biāo)，它能夠較好地、直接地反映氣道阻力的變化。對大鼠行氣道反應(yīng)性測定有助于進(jìn)一步研究哮喘的發(fā)生機(jī)制及免疫和病理生理機(jī)制具有重要意義[14]。本實(shí)驗(yàn)中對照組的肺順應(yīng)性和肺阻力呈相反狀態(tài)變化，說明在自然狀態(tài)下，隨著接觸外部環(huán)境的時間增多，肺部阻力是在增大的，肺的通氣功能是呈現(xiàn)下降的趨勢。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠隨著氨甲酰膽堿刺激濃度的不斷加大，肺阻力逐漸增大，順應(yīng)性逐漸降低，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。川芎嗪高、低劑量組大鼠的氣道高反應(yīng)性和模型組相比均有所改善，隨著氨甲酰膽堿刺激質(zhì)量濃度的增加，其所誘發(fā)各給藥組哮喘大鼠的肺阻力的增加及非順應(yīng)性的下降趨勢明顯弱于模型組，尤其是對于氨甲酰膽堿誘導(dǎo)的肺阻力的增加抑制作用明顯，且越高質(zhì)量濃度的氨甲酰膽堿刺激，藥物對氣道高反應(yīng)性的抑制作用越明顯。說明川芎嗪可明顯抑制哮喘急性發(fā)作時的氣道高反應(yīng)性，長期給予川芎嗪治療可能起到預(yù)防哮喘急性發(fā)作或減輕發(fā)作程度、降低致死率的作用。免疫球蛋白IgE，是介導(dǎo)I型超敏反應(yīng)的主要物質(zhì)。其數(shù)值的增高，與機(jī)體免疫系統(tǒng)有關(guān)。哮喘發(fā)生時IgE水平增高，可引起免疫細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致平滑肌收縮、黏液分泌增加、血管通透性增高和炎性細(xì)胞浸潤，促成哮喘的急性發(fā)作[15]。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)川芎嗪可降低哮喘大鼠血清IgE水平，但各組間數(shù)值絕對值變化不明顯，可能與IgE水平的影響因素眾多有關(guān)。肺組織HE染色結(jié)果表明川芎嗪能夠抑制哮喘大鼠肺組織嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤，說明其可能對哮喘的急性發(fā)作和炎癥發(fā)展有一定的防治作用。

已有的研究[16]表明川芎嗪可降低哮喘大鼠肺組織GATA-3和IL-5的表達(dá)，減少嗜酸性粒細(xì)胞在肺組織的浸潤，有效抑制哮喘的氣道炎癥。氣道炎癥性反應(yīng)降低，使氣道管徑增大，病變減輕，哮喘的癥狀得以緩解。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)川芎嗪對于哮喘大鼠模型中氨甲酰膽堿誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性有明顯的抑制作用，能夠改善大鼠肺功能，抑制血清IgE水平并抑制肺組織及氣道炎癥，可能對哮喘的急性發(fā)作起到預(yù)防作用，并改善哮喘發(fā)展過程中的慢性炎癥。但是川芎嗪為何會具有這些作用，這些作用發(fā)生的前提是什么？川芎嗪對哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性的抑制作用究竟來源于其抗炎作用還是松弛平滑肌或是二者兼有？其深層機(jī)制又是什么？是通過受體起效還是影響生化酶類？這些問題還有待于進(jìn)一步探討。

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