章運(yùn)典， 周里欣， 薛素娟， 陳玉海

(河南省宛西制藥股份有限公司，河南 南陽(yáng) 474500)

腦力寶丸由遠(yuǎn)志、地黃、五味子、地骨皮、菟絲子、茯苓、石菖蒲、川芎、維生素E、維生素B1等十味藥材組成，遠(yuǎn)志為其君藥，為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志或卵葉遠(yuǎn)志的干燥根。春、秋二季采挖，除去須根和泥沙，曬干[1]，具有滋補(bǔ)肝腎，養(yǎng)心安神之功效，臨床上多用于治療肝腎不足，心神失養(yǎng)等引起的健忘失眠等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2-3]。遠(yuǎn)志中皂苷類(lèi)成分居多，但因其分類(lèi)多且不夠穩(wěn)定，故《中國(guó)藥典》2010年版收載了遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ和3,6′二芥子酰基蔗糖為遠(yuǎn)志的指標(biāo)性成分。此方中五味子為臣藥，其含有豐富的木脂素類(lèi)，且性質(zhì)穩(wěn)定[4-5]。腦力寶丸原采用部頒標(biāo)準(zhǔn)[6]的薄層色譜法，隨著現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)的快速提高以及高效液相色譜技術(shù)的普及，原薄層色譜法因其操作復(fù)雜，重復(fù)性差，準(zhǔn)確度低等原因已滿足不了檢測(cè)要求，故在此選用遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、3,6′二芥子酰基蔗糖、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素為檢測(cè)指標(biāo)，建立了反相高效液相色譜法[7-12]，以此來(lái)提高檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，也可作為腦力寶丸內(nèi)部控制的方法依據(jù)。

1 材料和儀器設(shè)備

1.1 試藥 仲景牌腦力寶丸(批號(hào)120701、120702、120801)；遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ對(duì)照品(批號(hào)111850-201203)、3,6′二芥子?；崽菍?duì)照品(批號(hào)111848-201202)、五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào)110857-200709)、五味子甲素對(duì)照品(批號(hào)110764-201010)、五味子乙素對(duì)照品(批號(hào)110765-200710)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；HPLC用水為超純水，甲醇、乙醇、冰醋酸為色譜純，其他試劑為分析純，均經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)后使用。

1.2 儀器設(shè)備 Agilent 1100色譜儀；VWD檢測(cè)器；中興DZKW-4電子恒溫水浴鍋；UP超純水機(jī)；HANGPING FA2104V電子天平；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 遠(yuǎn)志 Agilent 1100色譜儀；Agilent HC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-0.05%磷酸(18∶82)為流動(dòng)相；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 五味子 Agilent 1100色譜儀；Agilent HC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇-水(75∶25)為流動(dòng)相；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.2 樣品制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ和3，6′二芥子?；崽菍?duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ0.012 5 mg、3，6′二芥子?；崽?.0436 mg的混合對(duì)照品貯備液；另精密稱(chēng)取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲0.174 mg、五味子甲素0.032 mg、五味子乙素0.056 mg的混合對(duì)照品貯備液。

2.2.2 遠(yuǎn)志中成分測(cè)定用供試品溶液制備 取本品30丸，除去糖衣，研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，加70%甲醇20 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流1.5 h，放冷，濾過(guò)，濾液置25 mL量瓶中，用少量70%甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器及濾器，洗液濾入同一量瓶中，加入70%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 五味子中成分測(cè)定用供試品溶液制備 取本品30丸，除去糖衣，研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，置50 mL量瓶中，加正己烷40 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理(頻率45 kHz，功率300 W)30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，加正己烷至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10 mL，揮干，殘?jiān)蛹状既芙?，? mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性供試品溶液制備 按處方比例分別制備不含遠(yuǎn)志和五味子的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)和“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備陰性供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取兩種對(duì)照品溶液,供試品溶液和陰性供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，結(jié)果表明陰性供試品溶液在與對(duì)照品峰相同的保留時(shí)間處無(wú)干擾峰出現(xiàn)，說(shuō)明處方中其他藥味對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下遠(yuǎn)志混合對(duì)照品貯備液1、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，再精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下五味子3種成分混合對(duì)照品貯備液2、4、6、8、10、12 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程分別為遠(yuǎn)志口山酮ⅢY=1 269.6X+2.242 3(r=0.999 4)，3，6′二芥子酰基蔗糖Y=1 662.5X+11.591(r=0.999)，五味子醇甲Y=426.86X-8.167 2(r=0.999 4)，五味子甲素Y=847.99X+8.733 3(r=0.999 4)，五味子乙素Y=664.24X-4.08(r=0.999 3)，結(jié)果表明遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ在0.012 5～0.250 μg，3,6′二芥子?；崽窃?.043 6～0.872 μg，五味子醇甲在0.348～2.088 μg，五味子甲素在0.064～0.384 μg，五味子乙素在0.112～0.672 μg范圍內(nèi)，其對(duì)照品質(zhì)量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下兩種對(duì)照品液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，按峰面積計(jì)算RSD值。遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、3,6′二芥子?；崽?、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的RSD分別為0.97%、0.86%、0.69%、0.71%和0.95%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)和“2.2.3”項(xiàng)下兩種供試品溶液，室溫放置，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，結(jié)果遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、3，6′二芥子?；崽恰⑽逦蹲哟技?、五味子甲素和五味子乙素峰面積RSD分別為1.26%、1.07%、1.33%、1.25%和0.98%，表明供試品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批樣品(批號(hào)120701)，按“2.2.2”項(xiàng)和“2.2.3”項(xiàng)下方法分別平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、3,6′二芥子酰基蔗糖、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的RSD值分別為1.13%、0.81%、1.24%、1.57%和1.16%，表明該方法重復(fù)性好。

2.8 回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取已知含有量(遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ0.44 mg/g、3,6′二芥子?；崽?.31 mg/g)的樣品(批號(hào)120701)約0.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入0.107 mg/mL遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ對(duì)照品溶液2 mL，0.326 mg/mL 3,6′二芥子酰基蔗糖對(duì)照品溶液2 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。再稱(chēng)取已知含有量(五味子醇甲3.05 mg/g、五味子甲素0.62 mg/g、五味子乙素1.42 mg/g)的樣品(批號(hào)120701)約0.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入0.83 mg/mL五味子醇甲對(duì)照液2 mL、0.311 mg/mL五味子甲素對(duì)照品溶液1 mL、0.712 mg/mL五味子乙素對(duì)照品溶液1 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ、3,6′二芥子?；崽恰⑽逦蹲哟技?、五味子甲素和五味子乙素的平均回收率分別為98.44%、98.21%、99.26%、98.82%、98.81%，RSD分別為1.30%、0.78%、0.54%、0.89%、1.01%，見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測(cè)定 取3批樣品(批號(hào)120701、120702、120801)，每批3份，按“2.2.2”項(xiàng)和“2.2.3”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)3批樣品進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，外標(biāo)法計(jì)算，數(shù)據(jù)以平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，測(cè)得結(jié)果如下表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

遠(yuǎn)志為腦力寶中的主藥，其有效成分為皂苷，遠(yuǎn)志口山酮，寡糖酯和生物堿等。原部頒標(biāo)準(zhǔn)中其薄層色譜法采用遠(yuǎn)志皂苷元水解液而不是總皂苷作為其中成分定量測(cè)定方法也證實(shí)了其不穩(wěn)定性，在分離遠(yuǎn)志的實(shí)驗(yàn)中多次發(fā)現(xiàn)已經(jīng)提純的皂苷又變成多個(gè)成分的混合物。故本實(shí)驗(yàn)選擇遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ和3,6′二芥子?；崽亲鳛檫h(yuǎn)志在腦力寶丸中的質(zhì)量控制指標(biāo)。五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素在254 nm處均有最大吸收，且用同一流動(dòng)相檢測(cè)，均能達(dá)到良好效果。故本實(shí)驗(yàn)對(duì)這3種成分同時(shí)測(cè)定，操作簡(jiǎn)便又節(jié)約資源。

腦力寶丸中遠(yuǎn)志皂苷元定量檢測(cè)采用的是衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十四冊(cè)薄層掃描法，該方法在操作中的點(diǎn)樣、展開(kāi)分離、顯色操作等步驟人為因素影響很大，且受環(huán)境溫濕度影響，達(dá)不到良好的檢測(cè)效果，依據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版一部采用HPLC法并增加了五味子中3種成分定量測(cè)定，提升了標(biāo)準(zhǔn)，避免了環(huán)境、人員影響，且操作簡(jiǎn)便，專(zhuān)屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，故該方法可作為該品種內(nèi)部控制的定量檢測(cè)方法。

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