趙 劍， 陳玉蘭， 蒲清榮， 黃 銳， 楊光華

(瀘州醫(yī)學院附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

茵陳四苓顆粒是瀘州醫(yī)學院附屬中醫(yī)醫(yī)院院內制劑，批準文號(川藥制字Z20070525)，主要由赤芍、梔子、茵陳、大黃、白術、茯苓等多味中藥組成。具有清熱除濕、利膽退黃的功效，用于慢性活動性乙型肝炎，肝硬化并發(fā)內毒素血癥屬肝膽濕熱證，經臨床應用多年， 療效顯著。為了更好的控制其質量，根據(jù)處方中中藥所含化學成分及其理化性質，結合“君、臣、佐、使”的中醫(yī)藥理論，按照《醫(yī)療機構制劑注冊管理辦法》的要求，采用TLC法對制劑中的茵陳和大黃進行定性鑒別[1-3]， 并采用HPLC法同時定量測定茵陳四苓顆粒中芍藥苷、梔子苷及大黃素、大黃酚，為綜合評價制劑的內在質量提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

SPD-20A高效液相色譜儀(美國科學系統(tǒng)公司)，UltimateTM C18鍵合硅膠柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，JPGT0328超聲提取器(武漢嘉鵬電子有限公司)，NRB17S3W電冰箱(日本松下)，ZK072型電熱真空干燥箱(上海實驗儀器廠)，JA203H電子天平(常州幸運電子)。芍藥苷(批號110736-200934)，梔子苷(批號110749-200309)，大黃酸(批號0757-200206)，大黃素(批號110756-200110)，大黃酚(批號110796-201118)，大黃(藥用大黃)對照藥材(批號120984-201202)，茵陳(茵陳蒿)對照藥材(批號121555-201101)均購于中國藥品生物制品檢定所；赤芍、梔子、茵陳、大黃等九味中藥購于瀘州市寶光中藥飲片公司，經瀘州市藥檢所中藥室袁常珍副主任中藥師鑒定，均符合《中國藥典》2010年版項下規(guī)定；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；娃哈哈純凈水；茵陳四苓顆粒(瀘州醫(yī)學院附屬中醫(yī)醫(yī)院，批號分別為20130217、20130218、20130219)。

2 薄層鑒別

2.1 茵陳的薄層色譜鑒別 取本品10 g，加水50 mL，攪拌溶解，離心，取上清液，用三氯甲烷振搖提取兩次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另按處方制成不含茵陳的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。另取茵陳對照藥材0.5 g，加水100 mL，煎煮30 min，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VI B)試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-丙酮(5∶3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%氫氧化鉀溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的藍色熒光斑點，陰性樣品無干擾[4-5]，見圖1。

圖1 茵陳的薄層色譜圖

2.2 大黃的薄層色譜鑒別 取本品10 g，加甲醇50 mL，浸泡1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25 mL使溶解，加鹽酸2.5 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。另按處方制成不含大黃的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液。另取大黃對照藥材0.1 g，加甲醇20 mL，浸泡1 h，濾過，濾液蒸干，同法制成對照藥材溶液。另取大黃酸、大黃素及大黃酚對照品，分別加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VI B)試驗，吸取上述溶液各4 μL，分別點于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H 薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點，陰性樣品無干擾[4-5]，見圖2。

圖2 大黃的薄層色譜圖

3 樣品中成分測定

3.1 茵陳四苓顆粒中芍藥苷、梔子苷定量測定與結果

3.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗 Inertsil ODS-SP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸水(15∶85)；體積流量1 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫40 ℃。理論塔板數(shù)按芍藥苷計算應不低于4 000[6-8]。

3.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷、梔子苷對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含芍藥苷0.183 mg、梔子苷0.26 mg的混合對照品溶液。

3.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.1.4 陰性對照溶液制備 按處方量并以相同的工藝制備不含赤芍和梔子的陰性對照樣品， 按供試品溶液的制備方法處理，得陰性對照溶液。

3.1.5 線性范圍的考察 分別精密吸取上述對照品溶液2.5、5、10、15、20 μL注入高效液相色譜儀，按選定的色譜條件測定，以進樣量(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得芍藥苷的回歸方程為Y=1×106X-55 680，r=0.999 8(n=5)，梔子苷為Y=1×106X-13 595，r=0.999 8(n=5)，結果表明芍藥苷對照品進樣量在0.458～3.66 μg范圍與峰面積線性關系良好，梔子苷對照品進樣量在0.65～5.2 μg范圍與峰面積線性關系良好。

3.1.6 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品及陰性對照溶液各 10 μL，注入液相色譜儀進行測定。結果陰性對照色譜中，在與對照品及供試品色譜圖對應保留時間處無相應色譜峰，表明其他成分對測定芍藥苷、梔子苷無干擾，見圖3。

圖3 茵陳四苓顆粒中梔子苷、芍藥苷的HPLC色譜圖

3.1.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，連續(xù)重復進樣5次，每次進樣10 μL測定峰面積，結果芍藥苷和梔子苷的峰面積RSD分別為1.35%、0.97%(n=5)，表明精密度良好。

3.1.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液于0、2、4、6、8、12 h分別進樣10 μL進行峰面積測定，結果芍藥苷和梔子苷的峰面積RSD分別為1.06%、1.15%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

3.1.9 重復性試驗 取同一批號樣品6 份， 按“3.1.3”項下方法制備供試品溶液， 以“3.1.1”項下色譜條件測定每份樣品中芍藥苷和梔子苷的量，結果芍藥苷的平均質量分數(shù)為1.657 mg/g，RSD為1.02%，梔子苷的平均質量分數(shù)為3.598 mg/g，RSD為1.16%，表明該方法重復性符合要求。

3.1.10 回收率試驗 精密稱取已測定茵陳四苓顆粒(芍藥苷1.655 mg/g，梔子苷3.596 mg/g)6份，每份約0.5 g，分別精密加入一定質量濃度的混合對照溶液，按“3.1.3”項下方法操作，制備供試品溶液，按“3.1.1”項下色譜條件下，分別進樣測定，計算回收率，結果芍藥苷的平均回收率為97.75%，RSD為1.13%(n=6)，梔子苷的平均回收率為98.27%，RSD為1.08%(n=6)，結果表明該方法的回收率良好，符合定量測定的要求[9]，見表1。

表1 芍藥苷和梔子苷加樣回收試驗

3.1.11 樣品測定 取茵陳四苓顆粒3批(20130217、20130218、20130219)，精密稱定，制成供試品溶液，利用外標兩點法測定，計算，測定結果見表2。

表2 樣品中芍藥苷和梔子苷測定結果

3.2 茵陳四苓顆粒中大黃素、大黃酚的測定

3.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗 Inertsil ODS-SP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；體積流量1 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫40 ℃。理論塔板數(shù)按大黃素峰計算應不低于3 000[10-11]。

3.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取大黃素對照品1.5 mg、大黃酚對照品2.75 mg，分別置25 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容至刻度，得對照品貯備液，分別精密量取0.1 mL貯備液，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL含大黃素0.000 6 mg、大黃酚0.001 1 mg的混合對照品溶液。

3.2.3 供試品溶液的制備 取本品1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 μm，即得。

3.2.4 陰性對照溶液制備 按處方量并以相同的工藝制備不含大黃的陰性對照樣品， 按供試品溶液的制備方法處理，得陰性對照溶液。

3.2.5 線性范圍的考察 分別精密吸取上述對照品溶液2.5、5、10、20、25 μL注入高效液相色譜儀，按選定的色譜條件測定，以進樣量(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得大黃素的回歸方程為Y=4×106X+1351.9，r=0.999 9(n=5)，大黃酚的回歸方程為Y=6×106X+6 608.6，r=0.999 8(n=5)，結果表明大黃素對照品進樣量在0.001 5～0.015 μg之間與峰面積線性關系良好，大黃酚對照品進樣量在0.002 8～0.028 μg之間與峰面積線性關系良好。

3.2.6 專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品及陰性對照溶液各 10 μL，注入液相色譜儀進行測定。結果陰性對照色譜中，在與對照品及供試品色譜圖對應保留時間處無相應色譜峰，表明其他組份對測定大黃素、大黃酚無干擾，見圖4。

圖4 茵陳四苓顆粒中大黃素、大黃酚的HPLC色譜圖

3.2.7 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，連續(xù)重復進樣5次，每次進樣10 μL測定峰面積，結果大黃素和大黃酚的峰面積RSD(n=5)分別為1.07%、0.85%，表明精密度良好。

3.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液于0、2、4、6、8、12 h分別進樣10 μL進行峰面積測定，結果大黃素和大黃酚的峰面積RSD分別為1.38%、1.12%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

3.2.9 重復性試驗 取同一批號樣品6 份， 按“3.2.3”項下方法制備供試品溶液， 以“3.2.1”項下色譜條件測定每份樣品中大黃素和大黃酚的量，結果大黃素的平均質量分數(shù)為0.046 mg/g，RSD為0.98%，大黃酚的平均質量分數(shù)為0.072 mg/g，RSD為0.82%，表明該方法重復性試驗符合要求。

3.2.10 回收率試驗 精密稱取已測定茵陳四苓顆粒(大黃素0.048 mg/g，大黃酚0.075 mg/g)6份，每份約0.5 g，分別精密加入一定量的對照品貯備液，按“3.2.3”項下方法操作，制備所需溶液，按“3.2.1”項下色譜條件下，分別進樣測定，計算回收率，結果大黃素的平均回收率為98.04%，RSD為0.68%(n=6)，大黃酚的平均回收率為98.83%，RSD為1.38%(n=6)，結果表明該方法的回收率良好，符合定量測定的要求，見表3。

3.2.11 樣品測定 取茵陳四苓顆粒3批(20130217、20130218、20130219)，每份一定量，精密稱定，制成供試品溶液，利用外標兩點法測定，計算，測定結果見表4。

表3 大黃素和大黃酚加樣回收試驗

表4 樣品中大黃素和大黃酚測定結果

4 討論

4.1 TLC 法是中藥鑒定的主要方法，是快速分離和定性分析的一種重要實驗技術?！吨袊幍洹?010 年版對常用中藥材及中成藥中主要成分制訂了薄層鑒別方法。本實驗對茵陳四苓顆粒處方中赤芍、梔子、茵陳和大黃進行TLC鑒別，結果表明，系統(tǒng)專屬性強，色譜特征斑點清晰，分離良好，無拖尾現(xiàn)象，可用于茵陳四苓顆粒的定性鑒別標準。

4.2 測定芍藥苷和梔子苷時，在流動相的選擇上，某些文獻采用梯度洗脫方式獲得了理想的分離度和塔板數(shù)[12-13]，本實驗先后用不同比例的乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，結果表明，以乙腈-0.1%磷酸( 15∶85) 等度洗脫芍藥苷峰已達到基線分離，理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計算不少于4 000，峰形對稱。既節(jié)省時間,又得到好的分離效果，故選其為本實驗流動相。

4.3 選擇大黃素和大黃酚流動相時，考慮大黃酸和大黃酚的極性較小，宜采用有機相比例較大的流動相，且這2種成分都含有酚羥基略顯酸性，故加入酸以抑制拖尾現(xiàn)象。本實驗分別考察了0.1%、0.2%、0.5%磷酸及乙酸，結果選擇0.1%的磷酸峰形良好，故選擇0.1%的磷酸水作為B相。

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