于學(xué)海， 禹玉洪， 宋海龍， 辛 艷， 李葆春， 孟亞雄， 馬小樂， 王化俊*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州730070；2.亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，山西 運(yùn)城 044602)

絞股藍(lán)中含有較豐富的絞股藍(lán)皂苷、糖類、黃酮類、無機(jī)元素等化學(xué)成分[1]。其中絞股藍(lán)皂苷活性最強(qiáng)，國(guó)內(nèi)報(bào)道已分離的有絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rd、人參皂苷F2、丙二醇、蕓香苷等[2]。研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)不僅可預(yù)防冠狀動(dòng)脈痙攣、心率不齊[3]。還具有降血糖[4]、降血壓[5]，抗腫瘤[6]、抗衰老[7]等作用。

分散片具有分散狀態(tài)佳、崩解時(shí)間短、藥物溶出迅速、吸收快、生物利用度高、不良反應(yīng)少、服用方便等特點(diǎn)。由于其獨(dú)特的性能，近年來分散片日益引起人們的關(guān)注[8]。絞股藍(lán)總苷分散片主要用于養(yǎng)心健脾，益氣和血，除痰化瘀，降血脂。本研究主要是建立10批絞股藍(lán)總苷分散片的指紋圖譜，并對(duì)絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rd、人參皂苷F2這3種特征成分進(jìn)行定量研究，為絞股藍(lán)總苷分散片質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，配有二元高壓梯度泵及chemstation色譜工作站)；AB265S 分析天平(梅特勒科技有限公司)；ELSD 2000ES檢測(cè)器(奧泰萬譜科技有限公司)；DK-98-Ⅱ型水浴鍋(北京靈諾科技有限公司)；KQ-5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 人參皂苷Rd對(duì)照品(批號(hào)130420，純度為97.6%)，絞股藍(lán)皂苷A對(duì)照品(批號(hào)130401，純度為99.4%)，人參皂苷F2對(duì)照品(批號(hào)130412，純度為98.8%)，以上3種對(duì)照品均為實(shí)驗(yàn)室自制；絞股藍(lán)總苷分散片(亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供，批號(hào)分別為120801、111201、120101、120102、120201、120901、130401、120512、121114、130608)；所用試劑除乙腈和異丙醇為色譜純外，甲酸、乙酸及乙醇為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果[9-12]

2.1 色譜條件 Phenomenex luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm )，流動(dòng)相為甲酸-異丙醇-水(1∶8∶91)(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～10 min，27%～29%B; 10～20 min，29%～35%B; 20～40 min，35%～36%B; 40～50 min，36%～38%B; 50～80 min，38%～47%B; 80～90 min，47%B)；ELSD檢測(cè)器；體積流量0.8 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫25 ℃，理論板數(shù)不低于3 000。色譜圖見圖1、圖2。

圖1 對(duì)照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱量絞股藍(lán)皂苷A,人參皂苷Rd,人參皂苷F2適量,分別制成質(zhì)量濃度為1.02、1.008、1.006 mg/mL的3種對(duì)照品貯備液，分別精密吸取貯備液適量，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為絞股藍(lán)皂苷A 0.51 mg/mL、人參皂苷Rd 0.252 mg/mL、人參皂苷F20.12072 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品約460 mg，精密稱定，至25 mL量瓶，加入約20 mL50%甲醇，超聲處理30 min，冷卻至室溫，用50%甲醇定容，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液4、6、8、10、12、14 μL，注入液相色譜儀，分別測(cè)得峰面積值，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積的Ln值(Y)為縱坐標(biāo)作圖。得回歸方程分別為Y絞股藍(lán)皂苷A=1.590 9X+5.601 6(r=0.999 4)，Y人參皂苷Rd=1.680 6X+5.798 4(r=0.999 5),Y人參皂苷F2=1.634 8X+5.749 2(r=0.999 7)。結(jié)果表明絞股藍(lán)皂苷A在2.04～7.14 μg，人參皂苷Rd在1.01～3.53 μg，人參皂苷F2在0.48～1.69 μg 范圍內(nèi)與色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，依據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rd及人參皂苷F2的保留時(shí)間的RSD分別為0.8%、1.3%及1.0%，峰面積的RSD分別為0.8%、0.9%及1.4%，3成分含有量的RSD分別為0.7%、0.6%及1.0%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為120801樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，平行制備6份，依據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rd及人參皂苷F2的保留時(shí)間的RSD分別為1.3%、0.9%及1.7%，峰面積的RSD分別為1.8%、0.9%及1.5%，3成分含有量的RSD分別為0.8%、1.4%及1.7%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品(批號(hào)120801)，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，依據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件，在0、2、4、6、8、12、16、20、24 h分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rd及人參皂苷F2的含有量的RSD分別為1.1%、1.9%及1.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取120801批樣品6份，每份約0.3 g，精密稱定，每2份為一組，3組分別加入絞股藍(lán)皂苷A貯備液4.8、4、3.2 mL，人參皂苷Rd貯備液2.4、2、1.6 mL、人參皂苷F2貯備液1.2、1、0.8 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，依據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果見表1～3。

表1 絞股藍(lán)皂苷A加樣回收率試驗(yàn)

表2 人參皂苷Rd加樣回收率試驗(yàn)

表3 人參皂苷F2 加樣回收率試驗(yàn)

2.9 指紋圖譜的建立及相似度分析

2.9.1 指紋圖譜的生成及共有峰的確定 吸取10個(gè)批次絞股藍(lán)總苷分散片供試品溶液各10 μL，依據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)行測(cè)定，運(yùn)用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2008版》相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件(下稱“軟件”)，得到10批樣品HPLC-ELSD指紋圖譜疊加圖(見圖3)，并且均有穩(wěn)定的20個(gè)特征峰。其中6號(hào)峰為絞股藍(lán)皂苷A，12號(hào)峰為人參皂苷Rd，18號(hào)峰為人參皂苷F2。

2.9.2 對(duì)照指紋圖譜的生成 據(jù)已建立好的色譜條件對(duì)10批樣品進(jìn)行測(cè)定，將結(jié)果運(yùn)用軟件進(jìn)行分析，以S1為參照?qǐng)D，經(jīng)過多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，生成對(duì)照指紋圖譜(R)，結(jié)果見圖3。

圖3 10批絞股藍(lán)總苷分散片HPLC-ELSD指紋圖譜(S1～S10)及對(duì)照指紋圖譜(R)

2.9.3 相似度分析 運(yùn)用軟件，采用夾角余弦法計(jì)算10批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的整體相似性，結(jié)果見表4。

2.10 樣品測(cè)定 取10批絞股藍(lán)總苷分散片約460 mg，按照“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，依據(jù)“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定每種產(chǎn)品中絞股藍(lán)皂苷A、人參皂苷Rd、人參皂苷F2的量。結(jié)果見表5。

表4 10批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜相似度結(jié)果

表5 樣品測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，不同批次的絞股藍(lán)總苷分散片中單體皂苷含有量及總皂苷差異均不大，說明絞股藍(lán)總苷分散片生產(chǎn)工藝較穩(wěn)定，技術(shù)較成熟，質(zhì)量較穩(wěn)定。

3 討論

3.1 檢測(cè)器與色譜條件的確定 對(duì)紫外和蒸發(fā)光兩種檢測(cè)器進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示紫外檢測(cè)信號(hào)較復(fù)雜，干擾較多，且人參皂苷F2、人參皂苷Rd幾乎沒有信號(hào)。相比之下，蒸發(fā)光檢測(cè)信號(hào)清晰，且色譜圖各特征峰分離度良好，峰型較好，故選用蒸發(fā)光檢測(cè)器。

分別對(duì)乙腈-乙酸-水、乙腈-甲酸-水、乙腈-異丙醇-水、乙腈-甲酸-異丙醇-水、乙腈-乙酸-異丙醇-水，柱溫20、25、30 ℃等色譜條件進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，在流動(dòng)相為乙腈-甲酸-異丙醇-水，柱溫為25 ℃色譜條件下，無論峰形還是分離度都較好。

3.2 提取方法的選擇 考察了超聲提取與回流提取方式，以及水、甲醇、50%甲醇、乙醇及50%乙醇提取溶劑，還有不同提取時(shí)間。結(jié)果表明，50%甲醇作為提取溶劑，超聲處理30 min為最佳的提取方法。

3.3 小結(jié) 本研究建立了10批絞股藍(lán)總苷分散片的HPLC-ELSD指紋圖譜，進(jìn)行了指紋圖譜分析，相似度均達(dá)到0.977以上，并測(cè)定了3種特征成分的量，3種成分相對(duì)較穩(wěn)定，說明絞股藍(lán)總苷分散片在生產(chǎn)工藝方面均較穩(wěn)定，制備工藝較接近。

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