朱彩霞， 王 超， 金麗華*

(1.東北林業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.西藏大學農(nóng)牧學院，西藏 林芝 860000)

綿頭雪兔子SaussurealanicepsHand.-Mazz. 為菊科風毛菊屬植物，又名綿頭雪蓮花、麥朵剛拉(西藏)，具有解毒除濕之功效，用于治療風濕痹癥、通經(jīng)、癲癇等[1]。近年來，國內(nèi)外有研究資料表明，綿頭雪兔子具有消炎止痛，抗氧化，清除自由基等作用[2-4]。

腸道黏膜除了具有消化吸收功能外，還能夠保護宿主免受病原微生物的入侵，是菌群與宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)者。當果蠅腸道受到外界環(huán)境刺激時，其腸道上皮細胞會對內(nèi)部和外部因子做出應答，以維持其腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。果蠅是研究昆蟲和人類腸道免疫的重要模式生物，利用果蠅研究中草藥對腸道免疫的作用，可以較快而深入地了解中草藥的功效。

本實驗利用多種病原微生物、炎癥離子和金屬離子等刺激因子喂食果蠅，通過果蠅生存率的變化、腸道上皮細胞及形態(tài)學變化來分析綿頭雪兔子提取物對果蠅腸道免疫功能的影響，以期為綿頭雪兔子在免疫功能方面的研究和進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與試劑 綿頭雪兔子來自西藏那曲地區(qū)，依據(jù)《西藏植物志》[5]鑒定。 NaCl和SDS購自Amresco；KAl(SO4)2購自Sigma公司；胰蛋白胨和酵母提取物購自Oxoid公司；其他試劑均為分析純。

1.2 果蠅與菌種 野生型黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster) W1118為實驗室保存，培養(yǎng)溫度 (25±1) ℃、相對濕度60%～70%。白僵菌(Beauveriabassiana)為實驗室保存；綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)由青島農(nóng)業(yè)大學單虎教授提供。

1.3 儀器 5417R型低溫離心機 (德國Eppendorf公司)；Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器 (美國Scientific Industries)；UV-1800型紫外分光光度計 (日本島津公司)；SZ51型顯微鏡 (日本Olympus公司)；Axioskop 2 plus型熒光顯微鏡 (德國Zeiss公司)。

2 方法

2.1 綿頭雪兔子提取液的制備 取綿頭雪兔子20 g，剪碎，加入400 mL去離子水浸泡24 h，加熱微沸3 h，過濾，再加入400 mL去離子水用同樣的方法提取2次，合并3次提取的濾液并加熱濃縮至200 mL，即得到質(zhì)量濃度為0.1 g/mL (10%) 的綿頭雪兔子提取液，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 果蠅培養(yǎng)基的配制 對照組的培養(yǎng)基配制方法參見文獻[6]。其中實驗組中加入與對照組去離子水等體積的綿頭雪兔子提取液，實驗組中綿頭雪兔子的質(zhì)量分數(shù)分別為2.5%和5%。

2.3 菌液的配制

2.3.1 細菌菌液的配制 綠膿桿菌(LB培養(yǎng)基，37 ℃) 接種到200 mL液體培養(yǎng)基中過夜擴大培養(yǎng)，將菌液4 000 r/min、25 ℃，離心10 min，棄上清，在沉淀中加入5%蔗糖溶液或含5%蔗糖的綿頭雪兔子提取液。

2.3.2 白僵菌孢子液的制備 將白僵菌在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d (25 ℃)，待其產(chǎn)孢后，刮取孢子加入到PBS中，充分振蕩均勻，過濾，測定A600值，配制成A600值為40的孢子液 (含5%蔗糖)。

2.4 果蠅生存率 分別隨機收集對照組和實驗組羽化了3 ～ 5 d的果蠅，每組中雌雄果蠅各15只。對各組果蠅饑餓處理2 h后轉移到放有5層濾紙的果蠅管中，分別加入致炎因子、細菌和孢子液等使濾紙充分潤濕。每24 h更換1次濾紙并記錄果蠅死亡數(shù)，每組實驗重復3次。

2.5 免疫染色 分別隨機收集對照組和實驗組羽化了3 ～ 5 d的雌果蠅，連續(xù)處理NaCl 5 d或SDS 4 d，顯微鏡下提取8～10條果蠅腸道于PBS中，7-AAD染色30 min，多聚甲醛固定10 min，DAPI染色10 min，甘油封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照，每組實驗重復3次。

2.6 腸道形態(tài)變化觀察 收集羽化了3～5 d的雌果蠅，SDS處理后，顯微鏡下提取8～10條果蠅腸道于PBS中，顯微鏡下觀察并拍照，每組實驗重復3次。

2.7 統(tǒng)計學處理 采用Prism軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 病原微生物對果蠅生存率的影響 真菌白僵菌的孢子感染6 d后，對照組果蠅的生存率降到15.8%，而喂食2.5%和5%綿頭雪兔子的實驗組分別為26.7%和66.7%，與對照組相比分別提高了10.9%和50.9% (P<0.01) (圖1A)。被革蘭氏陰性菌綠膿桿菌感染時，實驗組和對照組的生存率相似 (圖1B)。這表明綿頭雪兔子提取物可抵御真菌的感染，且隨著濃度的增加抵御能力增強。

3.2 致炎離子和金屬離子對果蠅生存率的影響 成體果蠅NaCl處理6 d后，對照組的生存率僅為7.6%，而喂食2.5%和5%綿頭雪兔子的實驗組分別為63.3%P<0.01 和53.3%P<0.02，提高了7.3倍和6倍 (圖2A)。SDS處理后，喂食2.5%和5%綿頭雪兔子的實驗組生存率分別為45.6% (P< 0.1) 和75.6% (P< 0.01)，是對照組(14.0%) 的3.2倍和5.4倍，并且5%綿頭雪兔子效果更為顯著 (圖2B)。另外，KAl(SO4)2處理果蠅6 d后，喂食5%綿頭雪兔子可顯著提高果蠅的生存率(P< 0.001)，其生存率88.9%是對照組41.1%的2.2倍，而喂食2.5%綿頭雪兔子的實驗組 (38.9%) 和對照組相似 (圖2C)。此結果說明綿頭雪兔子提取物可緩解致炎離子和金屬離子引起的損傷，顯著地提高了果蠅的生存率。

圖1 綿頭雪兔子提取物對病原體感染后果蠅生存率的影響

圖2 綿頭雪兔子提取物對致炎離子及金屬離子處理后果蠅生存率的影響

3.3 分析果蠅腸道上皮細胞 為了進一步驗證NaCl和SDS處理后綿頭雪兔子提取物對果蠅生存率的影響，本實驗利用7-AAD染色分析了腸道上皮細胞的死亡情況。結果表明，不管是NaCl還是SDS刺激，對照組的腸道上皮細胞均出現(xiàn)大量死亡，而喂食2.5%綿頭雪兔子的實驗組中腸道上皮細胞的死亡數(shù)量明顯減少，結果見圖3。

圖3 綿頭雪兔子提取物對NaCl(A)和SDS(B)處理后果蠅腸道上皮細胞的影響

3.4 分析果蠅腸道形態(tài)變化 對照組和實驗組SDS (0.6%)處理后分析果蠅的腸道形態(tài)變化。首先，SDS處理4 d后分離腸道，比較腸道的長度。結果表明，SDS處理的對照組與只喂食蔗糖的果蠅腸道相比，長度明顯縮短，而且在中腸和后腸連接處出現(xiàn)了明顯的黑色素瘤。當喂食2.5%綿頭雪兔子時，與對照組相比腸道長度明顯增加，而且沒有發(fā)現(xiàn)黑色素瘤，但是比只喂食蔗糖的果蠅腸道短一部分 (圖4A)。其次，分析了SDS不同處理時間對果蠅腸道壁厚度的影響。隨著處理時間的增加，對照組果蠅的腸道壁厚度逐漸變薄。而喂食2.5%綿頭雪兔子的果蠅腸道壁厚度沒有明顯變化，SDS處理后的第4天和第6天，果蠅腸道壁厚度基本相似 (圖4B)。這表明綿頭雪兔子提取物可保護腸道上皮細胞免受SDS誘導的炎癥損傷。

圖4 綿頭雪兔子提取物對SDS處理后果蠅腸道形態(tài)(A)和腸道壁厚度(B)的影響

4 討論

綿頭雪兔子含有芹菜素、紫丁香苷、β-谷甾醇、傘形花內(nèi)酯、雪蓮內(nèi)酯等物質(zhì)[7]。其中，芹菜素具有抗氧化、清除自由基、抗腫瘤和抗炎等作用[8-9]；紫丁香苷具有增強免疫力、抗氧化以及抗抑郁等作用[10-11]；β-谷甾醇是一種良好的抗氧化劑，具有很好的清除自由基的能力[12]。

腸道是人體內(nèi)最大的免疫器官。果蠅與人類的腸道具有相似的結構和功能；腸道干細胞的分化機制也十分相似；同時癌基因與腫瘤基因在果蠅與人類之間也是高度保守的。所以，可以利用模式生物果蠅研究調(diào)控腸道免疫相關的中藥及其復方。為了探討綿頭雪兔子對果蠅腸道免疫的影響，即其抵御病原微生物感染和抗炎的能力，本研究建立果蠅腸道免疫功能損傷模型，通過統(tǒng)計生存率、分析腸道上皮細胞死亡和觀察腸道形態(tài)變化等來探討綿頭雪兔子的免疫調(diào)節(jié)功能。結果顯示，綿頭雪兔子可抵御真菌白僵菌的感染，而對細菌綠膿桿菌的感染沒有保護作用。另外，綿頭雪兔子可緩解NaCl和SDS引起的炎癥反應，這可能是由于綿頭雪兔子保護了腸道上皮細胞免受炎癥的損傷，從而提高了腸黏膜的免疫功能。對于金屬離子誘導的損傷，5%綿頭雪兔子可提高KAl(SO4)2處理后果蠅的生存率，這可能是綿頭雪兔子減弱了KAl(SO4)2引起的脂質(zhì)過氧化反應[13]。只喂食5%蔗糖和綿頭雪兔子提取物時果蠅6 d內(nèi)的生存率沒有發(fā)生變化，而且果蠅在2.5%和5%的綿頭雪兔子培養(yǎng)基里的生長狀態(tài)與正常培養(yǎng)基相同，這說明蔗糖和綿頭雪兔子提取物對果蠅不會造成損傷。綜上所述，綿頭雪兔子可提高果蠅的腸道免疫功能，緩解病原微生物和炎癥因子引起的損傷，此結果為綿頭雪兔子的開發(fā)與利用提供了新思路。

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