馬洪超，李海普，楊兆光，徐前進，馬麗

(中南大學 化學化工學院，湖南 長沙，410083)

環(huán)境激素(environmental hormones)是指由于人類的生產(chǎn)和生活活動而釋放到周圍環(huán)境中可干擾生物體內正常分泌機制的外源性化學物質[1]，又稱為環(huán)境荷爾蒙或者內分泌干擾物。此類物質具有類似于雌激素的作用，能干擾人體和各種生物的內分泌，從而導致生物體生殖能力下降，免疫力降低，對于人類和動物的生殖發(fā)育具有極大的危害[2]。在諸多環(huán)境激素中，17β-雌二醇被認為是最具潛在影響、作用最強烈且在水環(huán)境中普遍存在的一種環(huán)境激素[3-4]。研究人員發(fā)現(xiàn)其在低質量濃度下就可以造成水生生物雌性化[5-6]，因此，研究更加有效的方法來分離富集水體中的17β-雌二醇顯得尤為重要并具有現(xiàn)實意義。分子印跡技術(molecular imprinting technique)是指為獲得在空間結構和結合位點上與某一分子(模板分子)完全匹配的聚合物的實驗制備技術。它通過以下方法實現(xiàn)：(1) 首先以具有適當功能基的功能單體與模板分子結合形成單體-模板分子復合物；(2) 選擇適當?shù)慕宦?lián)劑將功能單體互相交聯(lián)起來形成聚合物，從而使功能單體上的功能基在空間排列和空間定向上固定下來；(3) 通過一定的方法將模板分子脫去，這樣，就在聚合物中留下一個與模板分子在空間結構上完全匹配并含有與模板分子專一結合功能基的三維空穴。這3 種方法制造的分子印跡聚合物(molecularly imprinting polymers，MIPs)具有高選擇性地從結構類似的分子中識別模板分子的功能，MIPs 以其對模板分子具有的立體專一識別性越來越受到人們的青睞。近年來，該技術已廣泛應用于目標分子的分離富集[7-9]、色譜分離[10]、痕量物質的檢測[11-14]、化學與生物傳感器[15-17]等方面。在分子印跡聚合物的制備過程中，功能單體和溶劑的選擇尤為關鍵。模板分子和功能單體之間相互作用程度直接影響著分子印跡聚合物的選擇性和親和性。在功能單體和模板分子不能很好定向配位的印跡聚合物中，功能基團是任意分布的，這樣就會形成大量非選擇性或弱選擇性的結合位點，使印跡聚合物的特定選擇性降低。相反，若功能單體和模板分子的配合能力強，則能形成擁有許多高選擇性結合位點的聚合物，使聚合物對模板分子的結合能力大大提高。因此，功能單體的選擇對分子印跡聚合物的結合性能非常重要。此外，作為致孔劑的溶劑，其性質會影響聚合物顆粒的比表面積、形狀、空穴、均一度和剛性等，從而影響分子印跡聚合物對模板分子的結合性能。國內外已經(jīng)有關于17β-雌二醇分子印跡聚合物合成的報道，如：Celiz 等[18]借助17β-雌二醇分子中的羥基與羧酸基團間的作用，采用分子印跡技術，以甲基丙烯酸作為功能單體，17β-雌二醇為模板分子，乙腈為溶劑，合成了對17β-雌二醇具有選擇性結合能力的分子印跡聚合物；Noir 等[19]以4-乙烯基吡啶為功能單體，乙腈為溶劑合成了17β-雌二醇分子印跡聚合物。研究結果表明，采用17β-雌二醇為模板制得的分子印跡聚合物在其富集、萃取中均可發(fā)揮優(yōu)異的作用，并反映優(yōu)化其分子印跡聚合物的合成、降低合成成本應是研究的重點。國內研究者也已經(jīng)提出以甲基丙烯酸或者甲基丙烯酸甲酯為功能單體，乙腈、四氯化碳或氯仿為溶劑制備17β-雌二醇分子印跡聚合物[20-21]。但是，如何選擇最合適的功能單體和溶劑還沒有比較系統(tǒng)的研究方法，對以不同功能單體合成的聚合物的性能差異也沒有進行詳細比較。為此，本文作者借助紫外分光光度法系統(tǒng)研究模板分子17β-雌二醇與具有羰基基團的3 種常見單體丙烯酰胺(AM)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)之間的相互作用，以及模板分子與功能單體在3 種不同極性溶劑(乙腈、四氫呋喃、甲醇氯仿混合液)中的相互作用。進而采用分子印跡技術合成3種17β-雌二醇的分子印跡聚合物和3 種空白印跡聚合物，并運用平衡結合實驗研究它們對17β-雌二醇的結合性能，以期為17β-雌二醇分子印跡聚合物的合成及應用提供可靠方法與基礎數(shù)據(jù)。

1 實驗

1.1 儀器和試劑

試劑為：17β-雌二醇(Sigma，分析純即AR)；雌三醇(Sigma，AR)；α-甲基丙烯酸(MAA，天津市化學試劑研究所生產(chǎn)；AR，使用前用活性炭除去阻聚劑)；丙烯酰胺(AM，三井化學株式會社生產(chǎn)，AR，使用前用活性炭除去阻聚劑)；甲基丙烯酸甲酯(MMA，天津市科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn)，AR，使用前用活性炭除去阻聚劑)；偶氮二異丁腈(AIBN，天津市科密歐化學試劑有限公司生產(chǎn)，AR)；三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，化學純即CP)；甲醇(廣東省精細化學品工程技術研究中心生產(chǎn)，AR)；乙酸(廣東省精細化學品工程技術研究中心生產(chǎn)，AR)；乙酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，AR)；甲苯(衡陽市數(shù)信化工試劑有限公司生產(chǎn)，AR)；四氫呋喃(西隴化工股份有限公司生產(chǎn)，AR)。

儀器為：UV-450 型紫外分光光度計(上海棱光技術有限公司制造)；ZD-85A 恒溫水浴振蕩器(江西省金壇市榮華儀器制造有限公司制造)；Eppendorf centrifuge 5417 R 型高速冷凍離心機。

1.2 紫外光譜分析法對17β-雌二醇和不同功能單體之間的相互作用

以乙腈為參比分別掃描17β-雌二醇的乙腈溶液(0.05 mmol/L)，不同功能單體(AM，MAA 和MMA)的乙腈溶液(0.5 mmol/L)，以及 17β-雌二醇(0.05 mmol/L)和功能單體(0.5 mmol/L)乙腈溶液混合物的紫外吸收光譜。通過比較17β-雌二醇和不同功能單體之間的紫外吸收峰值的變化，來選擇最優(yōu)功能單體。

1.3 溶劑的選擇

通過考察模板分子17β-雌二醇與功能單體(MMA)在3 種溶劑(乙腈、四氫呋喃和甲醇氯仿混合液(V甲醇:V氯仿=1:1)中的紫外光譜吸收曲線，以尋找最合適的溶劑。

1.4 17β-雌二醇分子印跡聚合物的合成

分子印跡聚合物(MIPs)和空白印跡聚合物(NIPs)的制備(以模板分子和功能單體摩爾比1:6 為例)過程如下：將0.25 mmol 17β-雌二醇、1.5 mmol 功能單體、3 mmol TRIM 以及0.024 63 g AIBN 加入到15 mL 乙腈溶液中，超聲10 min，通氮除氧5 min。密封后轉入60 ℃恒溫水浴振蕩器中，轉速為280 r/min，24 h后離心分離得到聚合物。在索氏抽提器中用含體積分數(shù)為10%的乙酸的甲醇溶液抽提48 h，以洗脫除去模板分子，然后真空干燥?？瞻追肿佑≯E聚合物的合成方法與印跡聚合物的合成方法相同，只是不加模板分子。

1.5 聚合物對模板分子17β-雌二醇的平衡結合實驗

稱取20.0 mg 17β-雌二醇分子印跡聚合物或空白印跡聚合物，置于100 mL 磨口錐形瓶中，分別加入3 mL 不 同 濃 度 的 17β-雌 二 醇 乙 腈 溶 液(0.2～0.7 mmol/L)，放入恒溫水浴振蕩器中，于室溫下振蕩12 h。高速離心，取上清液，稀釋到可測濃度范圍內，用紫外分光光度計測定吸光度，并計算溶液中17β-雌二醇的濃度，根據(jù)結合前后溶液中17β-雌二醇的濃度變化可計算聚合物對17β-雌二醇的結合量Q。根據(jù)Q 作結合等溫線圖和Scatchard 圖，對聚合物的結合性能進行評價。

1.6 聚合物對模板分子17β-雌二醇的選擇性結合性能的影響

分別稱取20.0 mg 分子印跡聚合物和空白印跡聚合物，置于100 mL 磨口錐形瓶中，分別加入0.4 mmol/L 的17β-雌二醇乙腈溶液1.5 mL 以及0.4 mmol/L 雌三醇乙腈溶液1.5 mL，放入恒溫水浴振蕩器中，12 h 后高速離心，將上清液稀釋至一定的體積，用紫外分光測其吸光度，并計算溶液中17β-雌二醇以及雌三醇的濃度，根據(jù)結合前、后溶液中物質濃度變化可計算聚合物對各物質的結合量Q，以此評判聚合物的選擇性結合性能。

2 結果和討論

2.1 功能單體的選擇

17β-雌二醇的分子結構式可知其分子中含有剛性的環(huán)形結構和2 個羥基，這是分子印跡聚合物合成中可以利用的作用點?？紤]到羥基易于與富含電子的羰基及胺基發(fā)生氫鍵作用以及單體親疏水性的差異，選擇3 種常見的功能單體：甲基丙烯酸(MAA)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)以及丙烯酰胺(AM)。它們的分子結構見圖1。

圖1 模板分子17β-雌二醇和功能單體的結構及電荷分布圖Fig.1 Structures and charge distributions of 17β-estradiol and functional monomers

甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯以及丙烯酰胺這3種單體的親水性依次降低，可以調節(jié)與雌二醇間的疏水作用；同時，單體中均含有1 個羰基和1 個其他基團，分別是伯胺基、羥基和醚，也可以與雌二醇的羥基作用。圖1 中還顯示了各單體的分子結構以及采用Materials Studio 軟件中的QEq 方法得到分子中各原子電荷優(yōu)化得到的電荷分布[22]。由圖1 可知：單體AM中的羰基氧與胺基氮上的凈電荷分別為-0.225 eV 和-0.478 eV，MAA 中的羰基氧與羥基氧的凈電荷分別為-0.498 eV 和-0.691 eV，MMA 的羰基氧和醚基氧的凈電荷分別為-0.526 eV 和-0.581 eV。這樣的富電荷基團易于與雌二醇中缺電子的羥基氫發(fā)生氫鍵作用，并且電荷負電越多，作用應越強。

圖2 17β-雌二醇和功能單體混合前后的紫外吸收光譜圖Fig.2 UV spectra of sterol before and after mixed with different monomers

圖2 所示為17β-雌二醇/乙腈、單體/乙腈以及雌二醇-單體混合物/乙腈體系的紫外吸收光譜圖。17β-雌二醇和功能單體含有不飽和生色團(如乙烯基、羥基)，當含n 電子的助色團(如—OH，—OR 和—X 等)與生色團相連時，電子發(fā)生p-π 共軛，將增強生色團的生色能力(吸收波長向長波方向移動，且吸收強度增加)。從圖2(a)～(c)中曲線1 和3 對比可以看出：功能單體的加入使得光譜中的最大吸收波長均向長波長方向移動(紅移)，這表明17β-雌二醇和功能單體之間產(chǎn)生了相互作用，其中圖2(c)中的移動波長較多。另外，有研究顯示，曲線3 和4 的最大吸收峰值處吸光度相差越大，表明該功能單體與模板分子之間的相互作用越強[23]。圖2(a)中曲線3 和4 在219.5 nm 最大吸收峰處吸光度差值為0.886，圖2(b)中曲線3 和4 在216 nm最大吸收峰處的吸光度差值為0.772，而在圖2(c)中曲線3 和4 在217.5 nm 最大吸收峰處吸光度的差值為0.927。與圖2(a)和圖2(b)相比，圖2(c)中曲線3 和4最大吸收峰處的吸光度差值最大，說明MMA 與17β-雌二醇的相互作用更強。由于MMA 可以與雌二醇發(fā)生較強的氫鍵作用，同時與MAA 相比還具有稍強的疏水作用，因而，對合成17β-雌二醇分子印跡聚合物而言，MMA 是比MAA 和AM 更理想的功能單體。

2.2 溶劑的選擇

溶劑是分子印跡聚合物合成中的另一關鍵因素，不僅要能溶解模板分子和功能單體等物質，而且在聚合過程中發(fā)揮致孔劑的作用，同時對模板分子與功能單體之間的非共價鍵作用力將產(chǎn)生巨大影響，因此，選擇一種合適的溶劑對于制備高選擇性和強結合力的分子印跡聚合物至關重要。本文同樣采用紫外光譜分析法考察了模板分子17β-雌二醇與功能單體(MMA)在3 種溶劑乙腈、四氫呋喃和甲醇-氯仿混合液(V甲醇:V氯仿= 1:1)中相互作用，結果如圖3 所示。

從圖3 可見：在含有17β-雌二醇的3 種溶劑中逐步加入倍量的功能單體MMA 后，17β-雌二醇的最大吸收峰隨單體加入量的增加而逐步紅移。具體表現(xiàn)為在四氫呋喃溶液中，最大吸收峰從238.5 nm 移動到240.5 nm 處，僅有2 nm 的紅移(見圖3(a))；在甲醇-氯仿混合溶劑中最大吸收峰從238 nm 紅移到240 nm處，也有2 nm 的變化(見圖3(b))；而在乙腈溶劑中，當MMA 加入量從17β-雌二醇的3 倍體積量增加到6倍體積量時，最大吸收峰從214 nm 紅移到218 nm 處，移動了4 nm(見圖3(c))。

上述結果表明：模板分子17β-雌二醇與功能單體MMA 在甲醇氯仿混合溶劑以及四氫呋喃中產(chǎn)生的作用力均弱于其在乙腈溶劑中的相互作用，這說明乙腈是17β-雌二醇分子印跡聚合物合成過程中最適用的致孔劑。理論上的解釋為：以電荷發(fā)生相互作用的非共價聚合，更容易受到溶劑(致孔劑)的影響；當溶劑自身有弱的氫鍵時，結合能主要受溶劑介電常數(shù)的影響。乙腈的介電常數(shù)(37.5)大于甲醇-氯仿混合液的介電常數(shù)(19.065)和四氫呋喃的介電常數(shù)(7.25)，且乙腈的極性常數(shù)(6.2)也大于甲醇-氯仿混合液的極性常數(shù)(5.5)和四氫呋喃的極性常數(shù)(4.2)。在含有乙腈的活動相中，介電常數(shù)與溶劑極性之間的關系可能傾向于質子轉移，會形成帶電荷的離子化溶劑，隨著溶劑極性的增加會使得離子以較少的能量獲得消弱效應，增強模板分子和功能單體之間的相互作用。甲醇-氯仿混合液和四氫呋喃極性小，介電常數(shù)小，不易形成質子轉移?？梢姡喝軇┑姆N類對模板分子和功能單體之間的作用力影響很大，只有在適宜溶劑中模板分子與功能單體才能產(chǎn)生強的作用力，由此而獲得的聚合物的結合位點選擇性才能增強。

圖3 不同溶劑中17β-雌二醇-MMA 混合物的紫外光譜圖Fig.3 UV spectra of sterol- monomer mixture in different solvents

2.3 功能單體對印跡聚合物結合性能的影響

為了進一步比較AM，MAA 以及MMA 對分子印跡聚合物結合性能的影響，在相同條件下，分別以AM，MAA 和MMA 為功能單體合成17β-雌二醇的分子印跡聚合物和空白印跡聚合物，并考察它們對17β-雌二醇的結合性能，其結合等溫線如圖4 所示。

圖4 MIPs 和NIPs 的結合等溫線Fig.4 Binding isotherm of MIPs and NIPs

從圖4(a)可以看出：隨著測試濃度從0.2～0.7 mmol/L 不斷增大，以AM 為功能單體合成的MIPs 對17β-雌二醇的結合量也逐漸由4.854 μmol/g 增大到12.926 μmol/g，而NIPs對17β-雌二醇的結合量由2.992 μmol/g 增大到9.042 μmol/g，但始終低于MIPs 對模板分子的結合量。同樣由圖4(b)和圖4(c)可以看出：隨著測試濃度的增大，以MAA 和MMA 合成的分子印跡聚合物和空白印跡聚合物對模板分子的結合量逐漸增大，但是，空白印跡聚合物對模板分子的結合量始終低于分子印跡聚合物對它的結合量。

分子印跡中常用Scatchard 曲線來評價聚合物對模板分子的結合性能。將不同功能單體合成的聚合物對模板分子的結合等溫線進行Scatchard 分析，分析結果如圖 5 所示。根據(jù) Scatchard 方程：Q/c=(Qmax-Q)/Kd(其中Kd為結合位點的平衡離解常數(shù)，Qmax為結合位點的的最大表觀結合常數(shù)，c 為濃度)，由Q/c對Q 作圖可得到1 條直線，從直線的斜率和截距可以計算出Kd和Qmax。計算結果見表1。

從表1 可以看出：以AM，MAA 和MMA 作為功能單體，所合成的MIPs 對模板分子的最大結合量分別為27.077，30.500 和46.050 μmol/g，而NIPs 對模板分子的最大結合量為4.856，5.044 和3.272 μmol/g。由上述結果可以看出分子印跡聚合物對模板分子的最大結合量都大于空白印跡聚合物對模板分子的最大結合量，這充分說明分子印跡聚合物在結合模板分子方面具有明顯優(yōu)勢。另外，從表1 中還可以看出用MMA作功能單體所合成的分子印跡聚合物對17β-雌二醇表現(xiàn)出最大結合量，進一步證明在合成17β-雌二醇的分子印跡聚合物的過程中，與AM 和MMA 相比，MMA是更為合適的功能單體。

2.4 聚合物的選擇結合性

選用模板分子17β-雌二醇和與其結構類似的雌三醇作為底物，研究利用不同功能單體合成的聚合物對底物的選擇結合性能。表2 給出了各聚合物對底物的結合量。

由表2 可以看出：無論是用AM，MAA 還是MMA，作為功能單體合成的MIPs 對模板分子的結合量(分別為21.48，28.17 和40.27 μmol/g)都明顯高于NIPs 對模板分子的結合量(分別為3.22，3.07 和3.14 μmol/g)；而MIPs 對雌三醇的結合量(分別為15.19，17.46 和16.57 μmol/g)則明顯低于其對17β-雌二醇的結合量。應該是分子印跡聚合物中既存在與17β-雌二醇結合的功能基團，又存在與17β-雌二醇的立體結構互補的特定形狀孔穴，故此對模板分子具有高選擇性結合能力；而空白印跡聚合物中功能基團是任意分布的，因此，對模板分子沒有特異選擇性。這進一步表明在分子印跡聚合物合成過程中模板分子的重要印跡效應。

圖5 評價MIPs 和NIPs 結合性質的Scatchard 圖Fig.5 Scatchard plots to estimate binding nature of MIPs and NIPs

從表2 還可以看出：利用MMA 作為功能單體所合成的分子印跡聚合物對17β-雌二醇的結合量高于以AM 和MAA 為功能單體合成的分子印跡聚合物對17β-雌二醇的結合量。再次印證在合成17β-雌二醇的分子印跡聚合物時，MMA 更適合作為功能單體。

表1 不同MIPs 和NIPs 的Kd 和QmaxTable 1 Kd and Qmax of different MIPs and NIPs

表2 平衡條件下MIPs 和NIPs 對不同底物的結合量Table 2 Binding amounts of tested substrates on different MIPS and NIPs under equilibrium binding conditions μmol/g

3 結論

(1) 甲基丙烯酸甲酯分子中的氧原子上帶有較多的負電荷，且具有比丙烯酰胺和甲基丙烯酸稍強的疏水性，故在17β-雌二醇分子印跡聚合物制備過程中是較理想的功能單體；乙腈與四氫呋喃和氯仿甲醇混合液相比極性較大，且介電常數(shù)較大，是17β-雌二醇分子印跡聚合物制備過程中更適宜的溶劑。

(2) 以丙烯酰胺、甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯為功能單體所制得的MIPs 較NIPs 對模板分子具有較大的結合量和良好的選擇性結合性能，它們對17β-雌二醇的最大結合量分別為27.077，30.500 和46.050 μmol/g，平衡離解常數(shù)分別為1.166，1.106 和1.515 mmol/L；其中以甲基丙烯酸甲酯為功能單體所制得的MIPs 在選擇性結合實驗中對17β-雌二醇的結合量可達40.27 μmol/g，而對雌三醇的結合量僅為16.57 μmol/g，顯示出其對模板分子的優(yōu)良選擇結合性能。

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