武繼偉

何首烏為蓼科多年生草本植物的塊根。一直以來(lái)被認(rèn)為具有益壽延年、延緩衰老之功效，系著名的滋補(bǔ)中藥［1］。研究表明，何首烏中的主要水溶性成分為2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D 葡萄糖苷(2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG，二苯乙烯苷)［2］。2000年藥典將測(cè)定THSG化合物的含量作為何首烏及其制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。典靈輝等［3］發(fā)現(xiàn)何首烏的乙酸乙酯提取物能促進(jìn)大鼠顱骨成骨細(xì)胞的增殖，并根據(jù)粗提物含量測(cè)定結(jié)果推測(cè)發(fā)揮這種作用的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是THSG。本研究旨在從細(xì)胞水平證實(shí)THSG對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化的影響并初步探明其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 THSG由本實(shí)驗(yàn)室提取，經(jīng)

HPLC檢測(cè)純度＞98%;DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Hyclone公司);胰蛋白酶、青霉素G、硫酸慶大霉素(Ameresco公司);MTT試劑、BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測(cè)試劑盒(南京生物建成公司出品);Elisa試劑(Invitrogen公司);其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離、培養(yǎng)與傳代:大鼠成骨細(xì)胞按照文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行分離、培養(yǎng)和傳代［4］，實(shí)驗(yàn)采用第3～4代細(xì)胞。將大鼠成骨細(xì)胞以5×104個(gè)/皿的密度接種于6孔板中，或以2×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)板中的細(xì)胞隨機(jī)分組，進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)處理。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理

1.2.2.1 細(xì)胞增殖測(cè)定:采用 MTT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。待細(xì)胞70%～80%融合時(shí)，除陰性對(duì)照組外，其余各組加入加入不同濃度的 THSG(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 和10 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 ml MTT(5 mg/ml)，培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)150 μl，振蕩10 min，使甲臢充分溶解，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度OD值。OD值大小與活細(xì)胞數(shù)成正比，細(xì)胞存活率以對(duì)照組為100%，給藥組的細(xì)胞存活率=給藥組的光吸收值(OD)/對(duì)照組光吸收值(OD)×100%。

1.2.2.2 細(xì)胞ALP活性比測(cè)定:于不同濃度二苯乙烯苷干預(yù)后第3天檢測(cè)ALP活性比，采用PBS液漂洗皿中細(xì)胞 3 次，每皿中加入 0.1%TritonX 100 500 μl，置于4℃冰箱內(nèi)12 h，期間將培養(yǎng)皿中裂解液置于－30℃冰箱中反復(fù)凍融3次。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)流程，檢測(cè)單位體積裂解液中的ALP活性，同時(shí)使用BCA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的總蛋白濃度做內(nèi)參調(diào)平，計(jì)算每克樣本中ALP的活性。

1.2.2.3 Elisa方法檢測(cè):應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中c-fos和c-jun水平。在包被單抗的微孔中依次加入c-fos/c-jun抗原、生物素化的抗大鼠c-fos/c-jun抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的c-fos/c-jun呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。給藥組c-fos/c-jun的表達(dá)水平=給藥組的光吸收值(OD)/對(duì)照組光吸收值(OD)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，進(jìn)行one-way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THSG對(duì)細(xì)胞增殖活性影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較，在濃度0.03～10 mg/ml范圍隨濃度內(nèi)，隨著THSG濃度的升高，成骨細(xì)胞增殖活性明顯增高(P＜0.05 或 ＜0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 THSG對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖活性的影響(*P ＜0.05 或#P ＜0.01)

2.2 THSG對(duì)細(xì)胞ALP表達(dá)影響 2組成骨細(xì)胞ALP活性比檢測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較，在濃度0.03～10 mg/ml范圍隨濃度內(nèi)，隨著THSG濃度的升高，成骨細(xì)胞ALP表達(dá)顯著上升(P＜0.05或 ＜0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 THSG對(duì)大鼠成骨細(xì)胞ALP表達(dá)的影響(*P ＜0.05 或#P ＜0.01)

2.3 THSG對(duì)c-fos和c-jun蛋白表達(dá)的影響 經(jīng)以上處理第3天時(shí)，2組細(xì)胞c-fos和c-jun表達(dá)較對(duì)照組明顯增高(P＜0.05或 ＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 THSG對(duì)大鼠成骨細(xì)胞c-fos和c-jun表達(dá)的影響±s

表1 THSG對(duì)大鼠成骨細(xì)胞c-fos和c-jun表達(dá)的影響±s

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

c-fos 1.00 ±0.15 1.08 ±0.07* 1.20 ±0.15# 1.35 ±0.09#c-jun 1.00 ±0.25 1.10 ±0.03* 1.30 ±0.12# 1.40 ±0.60#

3 討論

多年來(lái)，何首烏的研究大多停留在對(duì)何首烏粉、制首烏或何首烏粗提物的功效性探究。采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段，深入研究其主要成分的藥理作用對(duì)中藥走向現(xiàn)代化走向世界具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法檢測(cè)主要水溶性成分THSG對(duì)細(xì)胞增殖的影響，具有靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，何首烏的THSG在0.03～10 mg/ml的寬廣范圍內(nèi)有明確的促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用，表現(xiàn)出高效、低毒的特點(diǎn)。

堿性磷酸酶ALP是成骨細(xì)胞分化的主要特征性酶之一，可以水解有基磷酸酯，提高局部無(wú)機(jī)磷離子的濃度，促進(jìn)鈣化的發(fā)生。對(duì)ALP活性的檢測(cè)是鑒定成骨細(xì)胞和評(píng)價(jià)其功能活性的重要指標(biāo)之一。本研究顯示，保持較高的ALP活性是THSG體外促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞分化成熟的典型特征之一。

C-fos和c-jun是與細(xì)胞增殖相關(guān)的原癌基因，是調(diào)控細(xì)胞分化和發(fā)育的即刻早期基因，亦稱快速反應(yīng)基因，因在外界因素刺激后迅速表達(dá)而得名［5］。C-fos和c-jun在正常情況下大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)均有低水平的表達(dá)。在外來(lái)因素刺激下，c-fos和c-jun經(jīng)過(guò)廣泛的修飾加工后跨核膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，二者通過(guò)亮氨酸拉鏈形式1∶1構(gòu)成異源二聚體或同源二聚體，與靶基因上調(diào)節(jié)區(qū)轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合后影響靶基因表達(dá)，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。本研究中，THSG顯著誘導(dǎo)c-fos和c-jun，可能是其促進(jìn)增殖和破骨細(xì)胞的分化、成熟的機(jī)制之一。

1 呂麗爽.何首烏中二苯乙烯苷的研究進(jìn)展.食品科學(xué)，2006，27:608-615.

2 張純，楊少麟.高效液相色譜法測(cè)定何首烏中二苯乙烯甙的含量及其穩(wěn)定性考察.中國(guó)中藥雜志，1999，24:357-360.

3 典靈輝，程紀(jì)倫，陸江贏，等.德慶何首烏提取物對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40:8885-8886.

4 韓娜，王天兵，寇玉輝，等.人工虎骨粉干預(yù)大鼠成骨細(xì)胞增殖和Ⅰ型膠原的表達(dá).中國(guó)組織工程研究，2012，16:201-205.

5 武密山，趙素芝，任立中，等.柚皮苷對(duì)乳鼠成骨細(xì)胞增殖及c-fos、cjun表達(dá)的影響.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27:677-681.