劉小甜，楊明英，張海萍，朱良均

絲素蛋白緩釋微球的研究進(jìn)展

劉小甜，楊明英，張海萍，朱良均

1 前言

微球作為一種重要的控/緩釋給藥體系，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用研究。微球是以高分子材料為載體包裹或吸附藥物而制成的微小球狀實(shí)體，粒徑范圍一般為1～500 μm。絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然蛋白質(zhì)，具有良好的生物相容性、可降解性和理化性能，被廣泛應(yīng)用于手術(shù)縫合線(xiàn)、人工皮膚、組織工程材料、細(xì)胞培養(yǎng)基、藥物緩釋載體等［1-4］。

以絲素蛋白為原料制備的絲素微球，具有比表面積大、生物相容性好、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛地研究。本文主要介紹了純絲素蛋白微球和絲素蛋白復(fù)合微球的研究現(xiàn)狀，總結(jié)了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并對(duì)絲素微球的發(fā)展前景做出了展望。

2 研究進(jìn)展

2.1 純絲素蛋白微球

吳海燕［5］以絲素蛋白（SF）為載體，以地塞米松磷酸鈉（DSP）為藥物模型，采用W/O/W型復(fù)乳法，制備絲素微球和絲素載藥微球，研究結(jié)果表明絲素微球的平均粒徑在0.56～56.52 μm之間。純絲素的結(jié)構(gòu)主要為無(wú)定型，使用不同的有機(jī)溶劑、不同的有機(jī)溶劑與絲素比例、不同的絲素濃度制得的絲素微球和絲素載藥微球，其結(jié)構(gòu)也有所不同，試驗(yàn)所制備絲素微球中絲素蛋白的分子構(gòu)象主要為β-折疊。

孫春光等［6］通過(guò)磷酸鹽緩沖液及乙醇綜合處理絲素蛋白溶液得到顆粒直徑比較均勻的納米級(jí)絲素顆粒。試驗(yàn)以柳氮磺吡啶為模式藥物，發(fā)現(xiàn)絲素蛋白與藥物的結(jié)合是通過(guò)在pH 8.0的磷酸鹽緩沖液作用下絲蛋白鏈狀膠束結(jié)構(gòu)發(fā)生聚集而將藥物包裹，自組裝形成規(guī)則的直徑為200～600 nm的球形顆粒。研究結(jié)果表明加入納米絲素蛋白的絲素載體使達(dá)到最高藥物濃度的時(shí)間比單純藥物粉末延長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，有利于機(jī)體對(duì)藥物的有效吸收利用。將絲素載體藥物用于治療人工誘導(dǎo)小鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎，結(jié)果證實(shí)了納米絲素蛋白具有良好的載藥、釋藥功能。

Cao等［7］將一定量的乙醇在持續(xù)攪拌下加入到絲素溶液中，經(jīng)冷凍-解凍處理后得到白色乳液，將乳液離心后冷凍干燥得到納米絲素微球。結(jié)果表明微球的形成與乙醇和絲素溶液的體積比密切相關(guān)，當(dāng)乙醇與絲素溶液的體積比在2∶20～9∶20范圍內(nèi)可形成分散性良好的絲素微球。

Xie等［8］用油相分離凝聚法制備的絲素微球使用了交聯(lián)劑戊二醛，微球的平均粒徑在16.2～34.7 μm，絲素載藥微球在l～24 h之間釋藥速度較快，大約釋放了總釋藥量的一半，24 h之后釋藥速度緩慢，添加交聯(lián)劑戊二醛的絲素微球的釋藥速度較不添加戊二醛的減慢。

Yeo等［9］用微型噴霧干燥器在流速為20 mL/min、85℃條件下獲得絲素蛋白微球。所得的絲素微球平均粒徑為4～10 μm。用噴霧干燥法獲得絲素微球，操作簡(jiǎn)單方便。在噴霧過(guò)程中絲素的構(gòu)象從無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?片層結(jié)構(gòu)。絲素微球具有很好的生物相容性，比其他合成材料在生物材料方面具有更好的應(yīng)用前景。

Zhang等［10］將脫膠的絲素纖維在氯化鈣/乙醇/水混合溶劑或高濃度溴化鋰溶液中溶解，獲得各種分子量分布范圍不同的液態(tài)絲素。用10 mL注射器抽取一定量的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.5%～5.0%的絲素溶液，磁力攪拌下快速注入40℃恒溫的過(guò)量丙酮中，立即變性形成乳白色懸浮液，或者轉(zhuǎn)移至離心管置于高速冷凍離心機(jī)中，以16000 r/min的速度離心30 min，棄去上清液后，沉淀物用去離子水反復(fù)沖洗，重復(fù)操作離心3～4次。得到的絲素顆粒不溶于水，但是經(jīng)過(guò)分散處理或超聲處理可以很好地分散在水或水溶液中。外形呈球形，粒徑35～125 nm左右。該絲蛋白微球有望用于生物材料尤其是藥物緩釋載體方面。

黃永利等［11］將絲素蛋白溶液進(jìn)行熱處理，調(diào)控其結(jié)構(gòu)和形態(tài)，在低壓電場(chǎng)的作用下，制備出絲素蛋白微球，并通過(guò)工藝變化研究了絲素蛋白微球的形成機(jī)制。結(jié)果表明，溶液中絲素蛋白的納米結(jié)構(gòu)對(duì)絲素微球的形成具有關(guān)鍵性調(diào)控作用。并以絲素蛋白微球?yàn)檩d體，進(jìn)一步探索了其在藥物釋放，生物礦化等領(lǐng)域的可能性。

楊道偉等［12］以絲素蛋白為載體，以降糖藥物二甲雙胍為模型藥物，Span80為乳化劑，采用乳化固化法制得二甲雙胍絲素微球。所制得的微球光滑圓整，成球性良好，微球的粒徑分布在4～40 μm之間。并探索出最佳工藝條件：投藥比為7%、轉(zhuǎn)速為300 r/min、水油比為11∶100，載藥量可達(dá)5.8%。該二甲雙胍絲素微球制備方法簡(jiǎn)單，生物相容性良好，可在常溫常壓下制備，易于擴(kuò)大生產(chǎn)。

Wen等［13］通過(guò)新的方法——超微粒處理系統(tǒng)制備出絲素蛋白微球，用此法制備微球有許多優(yōu)點(diǎn)：球形規(guī)則，粒徑分布范圍較窄，微球表面光滑，藥物能均勻的分布在絲蛋白載體中。與一般的微球制備方法相比，通過(guò)超微粒處理系統(tǒng)制備微球可以避開(kāi)一般方法所遇到的問(wèn)題，比如表面活性劑與交聯(lián)劑的潛在毒性，包封率過(guò)低，必須要水洗步驟等?？傊摲椒ㄓ型糜谏a(chǎn)絲素蛋白微球來(lái)作為長(zhǎng)期蛋白質(zhì)藥物的釋藥載體。

李貴軍［14］通過(guò)調(diào)節(jié)pH值，利用柞蠶絲素蛋白的自組裝，制備出了具有很好分散性和外形規(guī)整的，粒徑分布在5 μm左右的載羅丹明的柞蠶絲素微球和載溶菌酶的柞蠶絲素微球。結(jié)果表明：微球的載藥率隨著藥物加入量的增加而增加，而包封率則相反。在微球的釋藥過(guò)程中，開(kāi)始存在突釋?zhuān)浜筮M(jìn)入緩慢、穩(wěn)定的釋放階段，在第20 d的時(shí)候釋放了70%左右。通過(guò)對(duì)載溶菌酶柞蠶絲素微球的研究表明，柞蠶絲素蛋白微球可以被蛋白酶降解，載溶菌酶柞蠶絲素微球的降解速度略大于純柞蠶絲素微球。

王春增［15］將絲素蛋白（SF）作為重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（rhBMP-2）的緩釋載體，采用冷凍干燥法制備合適粒徑的絲素蛋白/rhBMP-2微球。并進(jìn)一步通過(guò)溶液共沉淀法合成含SF/rhBMP-2微球的雙相磷酸鈣（BCP）人工骨材料。結(jié)果表明絲素蛋白/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2/雙相磷酸鈣人工骨材料的強(qiáng)度大于松質(zhì)骨水平，其孔隙率及孔徑可調(diào)；絲素蛋白/重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2/雙相磷酸鈣人工骨材料可以誘導(dǎo)粘附、生長(zhǎng)在其表面的細(xì)胞向成骨方向分化，對(duì)細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)無(wú)影響，其作為組織工程骨的支架材料是可行的。

2.2 絲素蛋白復(fù)合微球

張幼珠等［16］以液體石蠟作連續(xù)相、Span80為乳化劑、戊二醛為交聯(lián)劑，在W/O型乳化體系中制備再生絲素蛋白—?dú)ぞ厶前幬⒛z囊，探討了制備工藝條件對(duì)微膠囊的影響；結(jié)果表明：微囊的形成及其粒度大小的均勻性與乳化條件，交聯(lián)劑用量等密切相關(guān)；紅外光譜，X-射線(xiàn)衍射圖譜等證明絲素與殼聚糖分子間具有強(qiáng)相互作用，微囊表面包覆的絲素分子鏈結(jié)晶程度和規(guī)整度提高。這種結(jié)構(gòu)有利于微囊強(qiáng)度的提高。

Wang等［17］分別以聚乳酸和海藻酸鹽微球?yàn)榈孜铮詿晒鈽?biāo)記的絲素蛋白作為涂層，并以辣根過(guò)氧化物酶和牛血清白蛋白作為模式藥物，研究其緩釋性能，發(fā)現(xiàn)與沒(méi)有絲素涂層的對(duì)照組相比，有絲素蛋白涂層的聚乳酸或海藻酸鹽微球能夠明顯的延緩藥物的釋放。

張光宇等［18］以液體石蠟為油相，殼聚糖與絲素蛋白的物理混合溶液為水相，去甲斑蝥素為模型藥物，Span80為乳化劑，戊二醛為交聯(lián)劑；采用乳化-交聯(lián)固化法制備去甲斑蝥素殼聚糖-絲素蛋白微球。制備出的微球形態(tài)圓整，粒徑均勻，具有較高的載藥量，緩釋作用良好，交聯(lián)劑戊二醛用量對(duì)微膠囊的釋藥性能有較大的影響。此外，該微球制備技術(shù)成熟，工藝操作易于控制，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

韓龍龍等［19］以模型藥物消炎痛（吲哚美辛）作囊芯，再生絲素蛋白和海藻酸鹽（FB/AG）作囊膜，通過(guò)復(fù)凝聚法制備包藥微膠囊。結(jié)果顯示，微膠囊呈近似球型，粒徑為65 μm左右，粒徑呈正態(tài)分布，再生絲素蛋白與海藻酸鹽之間具有相互作用，結(jié)晶程度提高。采用藥物體外釋放法測(cè)其釋藥性能，該包藥微膠囊24 h的釋藥率為24%，海藻酸鹽微膠囊為42%，藥粉為80%，F(xiàn)B/AG復(fù)凝聚微膠囊具有雙層囊膜，降低了囊心中藥物的擴(kuò)散速度而具有較好的緩釋效果。

Wang等［20］通過(guò)絲素/PVA共混膜成功制備出絲素微球。絲素溶液與PVA溶液流延法成膜。將共混膜溶于超純水中，振動(dòng)、離心、除去上清液后再次離心，超聲波處理后低壓凍干得到絲素微球。此方法在微球制備過(guò)程中并無(wú)添加其他有機(jī)溶劑，是一種有潛力的藥物載體材料。

劉純［21］選用非甾體抗炎藥雙氯芬酸鈉（Diclofe?nac Sodium，DS）作為模型藥物，以絲素蛋白（Silk Fi?broin，SF）和殼聚糖（Chitosan，CS）為載體，采用乳化-化學(xué)交聯(lián)固化法制備雙氯芬酸鈉絲素蛋白/殼聚糖緩釋微球，通過(guò)兩者之間的鍵合作用形成復(fù)合體，提高藥物的包封率和載藥量，利用微球溶脹特性，增強(qiáng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間，減少DS對(duì)胃腸道的刺激，降低毒副作用，延長(zhǎng)作用時(shí)間，提高其順應(yīng)性。研究結(jié)果表明：通過(guò)SF/CS分子間作用力結(jié)合形成的新型緩釋制劑，能夠明顯減緩釋藥速度，適合作為緩釋制劑供口服給藥。

另外，本實(shí)驗(yàn)室利用蠶絲蛋白與β-環(huán)糊精的優(yōu)良性能，制備出一種絲素納米顆粒/β-環(huán)糊精高分子微球，并對(duì)高分子微球的結(jié)構(gòu)性能進(jìn)行表征，有望將其作為新型給藥載體來(lái)提高藥物穩(wěn)定性，改善微球的藥物突釋效應(yīng)。

3 結(jié)語(yǔ)

絲素微球材料因其優(yōu)良的性質(zhì)受到廣泛的關(guān)注，有望成為一種低毒性的新型緩控釋載體材料。其具有良好的組織相容性，無(wú)毒，無(wú)刺激；有良好的機(jī)械性能，優(yōu)良的通氣、透水性能；具有生物可降解性，降解速度可以調(diào)節(jié)控制；產(chǎn)物的可塑性較強(qiáng)，可根據(jù)需要設(shè)計(jì)成多種形態(tài)等，因此絲素蛋白作為藥物緩釋載體具有良好的應(yīng)用前景。但是目前，絲素蛋白微球仍然存在著一些需要改進(jìn)或深入探究的問(wèn)題，例如載藥量的增加相對(duì)于其他載體并不是非常明顯；不同制備方法對(duì)絲素蛋白微球釋藥性不同的影響機(jī)理等。

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［21］劉純.雙氯芬酸鈉絲素蛋白-殼聚糖緩釋微球的研究［D］.江蘇：蘇州大學(xué)，2009.

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江 杭州 310058）

微球是以高分子材料為載體包裹或吸附藥物而制成的微小球狀實(shí)體，粒徑范圍一般為1～500 μm。絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然蛋白質(zhì)，具有良好的生物相容性、可降解性和理化性能，被廣泛應(yīng)用于手術(shù)縫合線(xiàn)、人工皮膚、組織工程材料、細(xì)胞培養(yǎng)基、藥物緩釋載體等。以絲素蛋白為原料制備的絲素微球，具有比表面積大、可生物降解、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛地研究。本文介紹了絲素蛋白緩釋微球的研究現(xiàn)狀，并對(duì)絲素微球的發(fā)展前景做出了展望。

絲素蛋白；微球；緩釋

Research Progress of Silk Fibroin Sustained-release Microspheres

LIU Xiao-tian,YANG Ming-ying,ZHANG Hai-ping,ZHU Liang-jun
（Institute of Applied Bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

Microspheres are tiny spherical entities made of polymer as a carrier for wrapping or adsorption drugs,its par?ticle size range are generally 1～500 μm.Silk fibroin is a natural protein extracted from silk,which possesses good bio?compatibility,biodegradability and physical and chemical properties.Silk fibroin has been widely used in the operation suture,artificial skin,tissue engineering,cell culture,drug controlled release carrier and so on.Silk fibroin based micro?spheres,with large surface area,biodegradability and biocompatibility,have been widely studied.We introduce the cur?rent research situation of silk fibroin sustained-release microspheres and makes a expectation for the development of silk fibroin microspheres.

silk fibroin;microspheres;sustained-release

S886.9

A

0258-4069［2014］01-012-04

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)（CARS-22）

劉小甜（1989-），女，碩士研究生，從事蠶絲蛋白生物資源高分子材料研究。E-mail:xtianliu@126.com

朱良均，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail:ljzhu@zju.edu.cn