羅文靜 黃文 莫雪安 吳李碩

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)是嚴(yán)重威脅人類健康的重要感染性疾病，其引起的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥十分常見。人類免疫缺陷病毒-1型反式轉(zhuǎn)錄激活因子(HIV-1 transactivator of transcription，HIV-1 Tat)作為AIDS感染過程中的關(guān)鍵蛋白，可導(dǎo)致腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，炎性介質(zhì)表達(dá)，炎性細(xì)胞遷移，緊密連接蛋白降解，血-腦脊液屏障功能失調(diào)，從而引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[1-2]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)可下調(diào)氧化應(yīng)激敏感性和炎性反應(yīng)信號通路[3-4]，明顯抑制炎性反應(yīng)而發(fā)揮對HIV介導(dǎo)的腦內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的保護(hù)作用[1,3]。在所有炎性介質(zhì)中，細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)在感染的炎性細(xì)胞牢固黏附和遷移進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)釋放HIV病毒起到關(guān)鍵的作用[5]。本研究觀察PPARγ激動劑羅格列酮對HIV-1 Tat誘導(dǎo)的黏附分子ICAM-1、VCAM-1及蛋白激酶B(Akt)表達(dá)的影響，旨在探討PPARγ對HIV-1 Tat誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中黏附分子作用及其可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為HIV-1引起的神經(jīng)系統(tǒng)功能損害的防治提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1主要材料及試劑人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(human cerebral microvascular endothelial cells,hCMEC/D3)由法國巴黎第五大學(xué)P-O Couraud教授惠贈，內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(endothelial cell basal medium-2，EBM-2)購自Lonza公司，鼠膠原蛋白購自Trevigen公司，重組HIV-1 Tat clade-B 購自ProSpec公司，ICAM-1一抗、VCAM-1一抗、Akt1/2/3 (H-136)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自Santa Cruz 公司，磷酸化Akt(Ser473；D9E)購自Cell Signaling公司，PPARγ激動劑羅格列酮、PPARγ拮抗劑GW9662購自Alexis Biochemicals公司，Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑KP3721購自Echelon Biosciences Incorporated公司，RNA提取試劑盒購自Qiagen公司。

1.2方法

1.2.1主要試劑配制：將HIV-1 Tat完全溶解于EBM-2培養(yǎng)基，配成200 μg/mL儲存液，分裝后保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｓ捎贖IV-1 Tat易與血清結(jié)合，實(shí)驗(yàn)所有干預(yù)均在無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞80%～90%融合后進(jìn)行。將羅格列酮完全溶解于二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶劑中,配成1 mmol/L儲存液，分裝后保存于-20℃?zhèn)溆?，使用時稀釋為10 μmol/L工作濃度。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)：將人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞種植于預(yù)先以鼠膠原蛋白涂層的60mm培養(yǎng)皿中，采用EBM-2培養(yǎng)基，添加堿性成纖維細(xì)胞生長因子、氫化可的松、抗壞血酸、羥乙基哌嗪乙硫磺酸、青/鏈雙抗以及5%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清培養(yǎng)于37℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱，根據(jù)培養(yǎng)基顏色及細(xì)胞生長情況，1～2天換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合80%以上即傳代。

1.2.3細(xì)胞處理 將處于對數(shù)生長期80%～90%融合的hCMEC/D3分組。(1)采用蛋白免疫印跡法檢測hCMEC/D3黏附分子ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)(處理12 h)以及Akt蛋白表達(dá)(處理1 h)，分為如下4組：對照組(加入相同量的溶媒DMSO)、1 μg/mL HIV-1 Tat組、10 μmol/L羅格列酮組、1 μg/mL HIV-1 Tat+10 μmol/L羅格列酮組。(2)以Real-time RT-PCR法檢測ICAM-1、VCAM-1的mRNA表達(dá)(處理6 h)，具體分為如下8組：1～4組處理同上，另4組為10 μmol/L羅格列酮+1 μmol/L GW9662組、1 μg/mL HIV-1 Tat+10 μmol/L羅格列酮+1 μmol/L GW9662組、10 μmol/L羅格列酮+120 nmol/L KP3721組、1 μg/mL HIV-1 Tat+10 μmol/L羅格列酮+120 nmol/L KP3721組。實(shí)驗(yàn)時DMSO在培養(yǎng)液中的濃度控制在0.1%(體積分?jǐn)?shù))以內(nèi)。羅格列酮、GW9662及KP3721均提前2 h加入培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞后再加入HIV-1 Tat。

1.2.4蛋白免疫印跡：細(xì)胞經(jīng) 1×磷酸鹽緩沖液(PBS) 洗滌 3 次，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，4℃ 12 000 r/min離心15 min(離心半徑為8 cm)，收集上清液，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。每道加樣30 μg蛋白，10%(質(zhì)量濃度)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%(質(zhì)量濃度)脫脂牛奶的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(tris buffered saline with tween, TBST)封閉1 h，分別加入ICAM-1一抗(1∶1000)、VCAM-1一抗(1∶1000)，β-actin(1∶8000)，Akt1/2/3(1∶500)，磷酸化Akt(1∶2000)，4℃孵育過夜，1×TBST 洗 3 次(5 min/次)，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，1×TBST 洗 3 次(5 min/次)，化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，掃描圖像并用Image J 軟件 (NIH,USA)分析電泳條帶的密度。

1.2.5Real-time RT-PCR：按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，以提取的總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用ABI Prism 7000序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)測定mRNA的相對水平。運(yùn)用TaqMan Universal PCR Master Mix 和商品化探針及引物(Applied Biosystems)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋阂?5℃ 10 min作為初始的熱變性步驟，然后擴(kuò)增循環(huán)95℃ 15 s，60℃ 60 s，共進(jìn)行24～33個循環(huán)。以相對CT法計(jì)算分析mRNA表達(dá)。每個樣品通過管家基因18S rRNA 作為內(nèi)參使目標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，若方差齊性，采用LSD-t法進(jìn)行多重比較；若方差不齊則進(jìn)行Welch檢驗(yàn)，采用Tambane’s T2法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1蛋白免疫印跡法檢測黏附分子的蛋白表達(dá)將對照組標(biāo)準(zhǔn)化為1。HIV-1 Tat組ICAM-1和VCAM-1的蛋白水平較對照組顯著增加(P<0.05,P<0.01)。與HIV-1 Tat組相比，PPARγ激動劑羅格列酮可顯著地減少HIV-1 Tat 誘導(dǎo)的ICAM-1的表達(dá)(P<0.05)，然而羅格列酮對HIV-1 Tat 誘導(dǎo)的hCMEC/D3中VCAM-1的表達(dá)與HIV-1 Tat組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體結(jié)果見圖1。

2.2Real-timeRT-PCR法檢測黏附分子的mRNA表達(dá)將對照組標(biāo)準(zhǔn)化為1。與對照組相比，HIV-1 Tat可顯著增加hCMEC/D3中ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA水平(均P<0.01)；與HIV-1 Tat組相比，PPARγ激動劑羅格列酮可顯著地抑制HIV-1 Tat誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達(dá)(均P<0.01)，而這種抑制作用可以被PPARγ拮抗劑GW9662和Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑KP3721(均P<0.01)逆轉(zhuǎn)。具體結(jié)果見圖2。

2.3蛋白免疫印跡法檢測Akt蛋白表達(dá)將對照組標(biāo)準(zhǔn)化為1。HIV-1 Tat組hCMEC/D3中p-Akt水平較對照組顯著上調(diào)(P<0.01)，而此效應(yīng)可被PPARγ激動劑羅格列酮抑制(P<0.01)。具體結(jié)果見圖3。

3 討論

HIV-1 Tat是HIV-1轉(zhuǎn)錄必不可少的蛋白，研究表明其可顯著提高多種炎性介質(zhì)的表達(dá)從而誘導(dǎo)HIV感染的單核細(xì)胞浸潤進(jìn)入CNS，增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)[1,6-7],是HIV進(jìn)入腦部的關(guān)鍵因素。ICAM-1、VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族，參與炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答等。在正常情況下細(xì)胞表面黏附分子ICAM-1、VCAM-1呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)，而HIV轉(zhuǎn)基因老鼠或HIV感染患者的血漿或組織中ICAM-1和VCAM-l水平較高[8-9]，在某些病理因素刺激下,如HIV-1 Tat作用可引起ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)升高[5]。本研究結(jié)果顯示，HIV-1 Tat明顯上調(diào)hCMEC/D3中黏附分子ICAM-l、VCAM-l的表達(dá)，可能在促進(jìn)HIV感染進(jìn)程中起到重要的作用。

括號內(nèi)為相對分子質(zhì)量；與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與HIV-1 Tat組相比，#P<0.05

圖1蛋白免疫印跡法檢測PPARγ激動劑羅格列酮對HIV-1 Tat誘導(dǎo)的ICAM-1(A)和VCAM-1(B)蛋白表達(dá)的影響(n=3)

與對照組相比，*P<0.01；與HIV-1 Tat組相比，#P<0.01；與HIV-1 Tat+羅格列酮組相比，△P<0.01

圖2Real-time RT-PCR法檢測PPARγ激動劑羅格列酮對HIV-1 Tat誘導(dǎo)的ICAM-1 (A)和VCAM-1(B)mRNA表達(dá)的影響(n=5)

括號內(nèi)為相對分子質(zhì)量；與對照組比較，*P<0.01；與HIV-1 Tat組比較，#P<0.01

圖3蛋白免疫印跡法檢測PPARγ激動劑羅格列酮對HIV-1 Tat誘導(dǎo)的Akt蛋白表達(dá)的影響(n=3)

PPAR是一類抗炎核受體，包括PPARα、PPARβ/δ和PPARγ 3種表型。提高PPARγ活性可減弱HIV-1 Tat誘導(dǎo)的炎性介質(zhì)在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)[1]。PPARγ通過ERK和Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減弱細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和下調(diào)Caveolae相關(guān)的氧化還原信號抑制HIV-1誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶-9過度表達(dá)而發(fā)揮血管保護(hù)作用[4]。PPARγ還可抑制黏附分子ICAM-l、VCAM-l的表達(dá)[10-11]。然而，PPARγ對HIV-1 Tat在人腦血管內(nèi)皮中介導(dǎo)的黏附分子反應(yīng)所起的作用仍未明了。因此，本研究著眼于PPARγ對黏附分子ICAM-1和VCAM-1的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPARγ激動劑羅格列酮顯著下調(diào)HIV-1 Tat所誘導(dǎo)的hCMEC/D3中ICAM-l的蛋白表達(dá)，而對VCAM-1蛋白表達(dá)下調(diào)作用則較弱；同時，羅格列酮明顯抑制HIV-1 Tat誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1的mRNA表達(dá)，表明其抑制HIV-1 Tat誘導(dǎo)的黏附分子反應(yīng)；另外，羅格列酮對HIV-1 Tat誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的抑制作用可被PPARγ拮抗劑GW9662部分逆轉(zhuǎn)，提示羅格列酮作為PPARγ的高選擇性、強(qiáng)效激動劑，通過激活PPARγ發(fā)揮有效的抗炎作用，一旦PPARγ的活性受到抑制，則影響羅格列酮發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在于各種神經(jīng)細(xì)胞中，研究認(rèn)為PI3K/Akt通路介導(dǎo)了多種干預(yù)的神經(jīng)保護(hù)功能[4,12-13]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中處于核心地位，是PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個重要的下游靶激酶。本研究中HIV-1 Tat、羅格列酮和Akt抑制劑KP3721共處理的細(xì)胞中羅格列酮對HIV-1 Tat誘導(dǎo)的ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)下調(diào)作用被削弱，推測PPARγ通過Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制HIV-1 Tat誘導(dǎo)的黏附分子促炎反應(yīng)。另外，本文研究結(jié)果顯示HIV-1 Tat誘導(dǎo)hCMEC/D3中p-Akt水平上調(diào)，而這一效應(yīng)可被PPARγ激動劑羅格列酮抑制，可見羅格列酮激活PPARγ后，能夠阻遏HIV-1 Tat誘導(dǎo)的Akt磷酸化反應(yīng)。這與既往研究結(jié)果一致[14]。目前，PPARγ在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的作用機(jī)制仍未完全闡明，國內(nèi)也尚未有報道PPARγ對HIV-1 Tat誘導(dǎo)腦微血管炎性反應(yīng)影響及其機(jī)制的研究。

總而言之，PPARγ激動劑羅格列酮能夠抑制HIV-1 Tat誘導(dǎo)的黏附分子ICAM-1和VCAM-1表達(dá)上調(diào)，同時羅格列酮可抑制Akt的磷酸化，通過Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制HIV-1 Tat誘導(dǎo)的黏附分子促炎反應(yīng)。這將為PPARγ引入治療HIV介導(dǎo)的炎性反應(yīng)提供了依據(jù)，對HIV感染所致的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙疾病的臨床預(yù)防和治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

志謝：感謝法國巴黎第五大學(xué)P-O Gouraud教授為本研究惠贈人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系。

[1]Huang W, Rha GB, Han MJ, et al. PPARalpha and PPARgamma effectively protect against HIV-induced inflammatory responses in brain endothelial cells[J].J Neurochem,2008,107(2):497-509.

[2]Huang W, Eum SY, András IE, et al. PPARalpha and PPARgamma attenuate HIV-induced dysregulation of tight junction proteins by modulations of matrix metalloproteinase and proteasome activities[J].FASEB J,2009,23(5):1596-1606.

[3]Ramirez SH, Heilman D, Morsey B, et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) suppresses Rho GTPases in human brain microvascular endothelial cells and inhibits adhesion and transendothelial migration of HIV-1 infected monocytes[J].J Immunol, 2008,180(3):1854-1865.

[4]Huang W, Andras IE, Rha GB, et al. PPARalpha and PPARgamma protect against HIV-1-induced MMP-9 overexpression via caveolae-associated ERK and Akt signaling[J]. FASEB J,2011,25(11):3979-3988.

[5]Song HY, Ryu J, Ju SM, et al.Extracellular HIV-1 Tat enhances monocyte adhesion by up-regulation of ICAM-1 and VCAM-1 gene expression via ROS-dependent NF-kappaB activation in astrocytes[J].Exp Mol Med,2007,39(1):27-37.

[6]Toborek M, Lee YW, Pu H,et al. HIV-Tat protein induces oxidative and inflammatory pathways in brain endothelium[J]. J Neurochem,2003,84(1):169-179.

[7]Pu H,Tian J,Flora G,et al.HIV-1 Tat protein upregulates inflammatory mediators and induces monocyte invasion into the brain[J].Mol Cell Neurosci,2003,24(1):224-237.

[8]Melendez MM, McNurlan MA, Mynarcik DC， et al.Endothelial adhesion molecules are associated with inflammation in subjects with HIV disease[J].Clin Infect Dis,2008,46(5):775-780.

[9]Hag AM, Kristoffersen US, Pedersen SF， et al.Regional gene expression of LOX-1, VCAM-1, and ICAM-1 in aorta of HIV-1 transgenic rats[J].PLoS One,2009,4(12):e8170.

[10]Yu MK,Lee JC,Kim JH,et al.Anti-inflammatory effect of peroxisome proliferator activated receptor gamma on human dental pulp cells[J].J Endod,2009,35(4):524-528.

[11]Lee S,Kim W,Kang KP,et al.Agonist of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma, rosiglitazone, reduces renal injury and dysfunction in a murine sepsis model[J].Nephrol Dial Transplant,2005,20(6):1057-1065.

[12]Wang HY,Wang GL,Yu YH,et al.The role of phosphoinositide-3-kinase/Akt pathway in propofol-induced postconditioning against focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J].Brain Res,2009,1297:177-184.

[13]Xue Y,Xie N,Lin Y,et al.Role of PI3K/Akt in diazoxide preconditioning against rat hippocampal neuronal death in pilocarpine-induced seizures[J].Brain Res,2011,1383:135-140.

[14]Jang JH, Yang ES, Min KJ, et al.Inhibitory effect of butein on tumor necrosis factor-alpha-induced expression of cell adhesion molecules in human lung epithelial cells via inhibition of reactive oxygen species generation, NF-kappaB activation and Akt phosphorylation[J]. Int J Mol Med, 2012,30(6):1357-1364.