徐華榮，郭 楊，趙志東，李 托，張智英，王 昕

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點實驗室，陜西楊凌712100）

羊絨是由絨山羊次級毛囊產(chǎn)生的底層毛，其生長是一個周期性變化的過程，包括生長期、退行期和休止期［1］。羊絨品質(zhì)與角蛋白的組成相關(guān)，并受角蛋白基因表達(dá)的影響。角蛋白基因的表達(dá)差異導(dǎo)致不同品種絨山羊的羊絨品質(zhì)存在明顯差異［2］。在絨山羊中存在大量激活和抑制參與皮膚毛囊周期性生長的調(diào)控因子［3］，其中KAP基因家族角蛋白相關(guān)蛋白9.2（KAP9.2）基因在絨山羊皮膚組織中特異性表達(dá)，在奶山羊皮膚組織中不表達(dá)［4－5］。為進(jìn)一步研究羊絨周期性生長過程中KAP9.2基因的功能，需構(gòu)建KAP9.2過表達(dá)載體。但是在真核細(xì)胞中通常直接轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的效率很低，達(dá)不到研究基因功能的目的。本研究以陜北白絨山羊為研究對象，旨在構(gòu)建KAP9.2基因的重組腺病毒載體，并包裝擴(kuò)增KAP9.2重組腺病毒，為在細(xì)胞水平上研究KAP9.2基因功能提供材料和奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒與菌體 HEK293人胚腎細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BJ5183、試驗用質(zhì)粒pAdTrack－CMV和pAdEasy－1均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物基因組學(xué)實驗室保存。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶和T4DNA ligase購自DNA ligaseDNA ligaseNEB公司；Taq DNA聚合酶和核酸共沉劑購自TaKaRa公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA BIO－TEK公司；DNA凝膠回收試劑盒購自威格拉斯生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自Sigma公司；血清FBS購自Gibco公司；化學(xué)試劑為分析純，購自Sigma公司。

1.2 方 法

1.2.1 pAdTrack－KAP9.2腺病毒穿梭載體的構(gòu)建及鑒定 外科手術(shù)法采集陜北白絨山羊肩胛后緣1×2cm2皮膚組織，干冰保存帶回實驗室，－80℃冰箱保存。采用酚／氯仿法提取陜北白絨山羊皮膚組織DNA。根據(jù)GenBank中山羊KAP9.2基因（GenBank登錄號：AY510124）mRNA序列，利用Clone ManagerV7軟件，設(shè)計KAP9.2基因的特異性擴(kuò)增引物，由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，上游引物Primer F：5＇－GGAAGATCTTGAGAAAC TCAGCTCTGAGC－3＇下游引物Primer R5＇－ACGCGTCGACGTTCTATGACAGGAGGATCA－3＇。PCR擴(kuò)增KAP9.2基因。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，通過DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。使用Sal I－HF、Bgl II雙酶切回收產(chǎn)物和pAdTrack－CMV載體。連接KAP9.2目的基因和pAdTrack－CMV骨架載體，T4DNA ligase 0.5μL，10×T4DNA ligase Buffer 1.0μL，ddH2O 3.5μL同時設(shè)一組空白對照，16℃連接過夜。取5μL連接產(chǎn)物加入至100μL感受態(tài)DH5α中，在含有卡那霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)過夜。采用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，Sal I－HF和Bgl II雙酶切鑒定。選擇兩個酶切鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測序結(jié)果與NCBI公布的KAP9.2序列進(jìn)行比對。

1.2.2 pAdEasy－KAP9.2重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定 使用Pme I線性化測序結(jié)果正確的pAdTrack－KAP9.2。試驗組取5μL回收產(chǎn)物及1 μL pAdEasy－1共轉(zhuǎn)至100μL感受態(tài)BJ5183中，對照組只加5μL回收產(chǎn)物，在含有卡那霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)過夜。挑取試驗組平板上5個克隆，提取質(zhì)粒。使用Pac I酶切鑒定pAdEasy－KAP9.2重組質(zhì)粒。稀釋酶切鑒定結(jié)果正確的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增KAP9.2基因，擴(kuò)增鑒定正確的質(zhì)粒。

1.2.3 重組KAP9.2腺病毒載體線性化病毒包裝及擴(kuò)增 Pac I線性化重組腺病毒載體pAdEasy－KAP9.2。設(shè)置5個反應(yīng)體系，37℃充分反應(yīng)5h。核酸共沉劑濃縮回收。將回收的線性化產(chǎn)物轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好、融合度70%的HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染操作按梭華－SofastTM基因轉(zhuǎn)染試劑手冊進(jìn)行。參考AdEsayTM系統(tǒng)［20］所示的方法擴(kuò)增腺病毒，以達(dá)到后續(xù)試驗所需病毒量。

1.2.4 重組KAP9.2腺病毒滴度測定 采用LaSRT法［6－7］測定KAP9.2腺病毒滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 pAdTrack－KAP9.2穿梭載體的鑒定

以陜北絨山羊基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得KAP9.2基因全長CDS，瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶為670bp左右（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致；將該片段用Sal I－HF和Bgl II酶切后與同樣內(nèi)切酶切割的骨架載體pAdTrack進(jìn)行連接，獲得穿梭載體pAdTrack－KAP9.2；Sal I－HF和Bgl II雙酶切檢測載體時，獲得了長度約為9100bp骨架載體和658bp的KAP9.2片段（圖2），與預(yù)期結(jié)果一致，說明pAdTrack－KAP9.2穿梭載體構(gòu)建成功。將pAdTrack－KAP9.2載體測序，發(fā)現(xiàn)與NCBI中的序列完全匹配，表明pAdTrack－KAP9.2穿梭載體可用于后續(xù)的試驗研究。

圖1 PCR擴(kuò)增KAP9.2基因M.DL2000DNA Marker；1.回收KAP9.2PCR產(chǎn)物Fig.1 KAP9.2amplified by PCRM.DL2000DNA Marker；1.Gel purification of KAP9.2

2.2 pAdEasy－KAP9.2腺病毒載體的鑒定

使用Pac I酶切鑒定由線性化pAdTrack－KAP9.2與pAdEasy－1重組得到的pAdEasy－KAP9.2質(zhì)粒，可以得到36 701bp和2 897bp的兩個片段（圖3）。以pAdEasy－KAP9.2質(zhì)粒為模板，用擴(kuò)增KAP9.2基因引物進(jìn)行PCR檢測，獲得目的片段約為670bp（圖4），說明pAdEasy－KAP 9.2質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 pAdTrack－KAP9.2 Sal I－HF、Bgl II酶切鑒定M.DL2000DNA Marker；1－3.pAdTrack－KAP9.2酶切產(chǎn)物Fig.2 Identification of pAdTrack－KAP9.2vectorM.DL2000DNA Marker；1－3.pAdTrack－KAP9.2 double digested by Sal I－HF and Bgl II

2.3 重組KAP9.2腺病毒載體的線性化、病毒包裝、擴(kuò)增及滴度測定

pAdEasy－KAP9.2腺病毒載體經(jīng)Pac I線性化后，轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后第3d在熒光顯微鏡下可以觀察到有綠色熒光蛋白表達(dá)，培養(yǎng)到7d時，接近90%的細(xì)胞發(fā)出熒光，此時收集的病毒即為第1代病毒液，再反復(fù)感染3代后得到病毒滴度為1.34×108GFU／mL的病毒（圖5）。

圖3 pAdEasy－KAP9.2的酶切鑒定M.λ－HindⅢDNA Marker；1.pAdEasy－KAP9.2使用Pac I酶切線性化后產(chǎn)物Fig.3 Identification of pAdEasy－KAP9.2M.λ－HindⅢDNA Marker；1.pAdEasy－KAP9.2 digested with PacI

圖4 pAdEasy－KAP9.2的PCR鑒定M.DL2000DNA Marker；1.pAdEasy－KAP9.2為模板，PCR擴(kuò)增KAP9.2基因產(chǎn)物Fig.4 Identification of pAdEasy－KAP9.2by PCRM.DL2000DNA Marker；1.Amplification KAP9.2 from pAdEasy－KAP9.2

圖5 腺病毒原液分別稀釋103（A）、104（B）、105（C）、106（D）倍后轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞48h后綠色熒光的表達(dá)Fig.5 Fluorescence microscopic image of NIH3T3transfected by virus diluted by 103（A），104（B），105（C），106（D）times respectively after 48hours

3 討 論

KAP9.2基因是超高硫（USH）KAPs基因家族中一員，USH角蛋白相關(guān)蛋白在毛囊角質(zhì)層和皮質(zhì)層均表達(dá)［8］。KAP基因家族通過KAP－KAP、KP－KAP、KP－KP相互作用或受其他基因的調(diào)控進(jìn)而對絨毛品質(zhì)具有重要的影響［9－11］。對陜北白絨山羊和內(nèi)蒙古白絨山羊KAP6.2基因的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因在陜北白絨山羊上存在24bp的缺失突變，但是在內(nèi)蒙古白絨山羊上卻沒有出現(xiàn)，提示該基因的缺失突變可能是導(dǎo)致陜北白絨山羊羊絨多型性的直接原因［11］。研究發(fā)現(xiàn)陜北白絨山羊中KAP9.2基因同樣出現(xiàn)了30bp的缺失［13］。有報道發(fā)現(xiàn)KAP7.1基因與KAP8.2基因在絨山羊心、肝、肺、脾、腎組織中不表達(dá)，僅在皮膚組織中表達(dá)［14］。我們發(fā)現(xiàn)KAP9.2基因同樣僅在絨山羊皮膚組織中表達(dá)，在奶山羊中則沒有檢測到其表達(dá) 說明KAP9.2基因的表達(dá)具有品種特異性。本課題組研究發(fā)現(xiàn)KAP9.2基因?qū)ρ蚪q的生長可能具有抑制作用［15］，同時報道了關(guān)于KAP9.2的多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)在KAP9.2基因586位點存在C／T單核苷酸多態(tài)性，而CC基因型的KAP9.2基因相對表達(dá)量低于TT基因型，說明該位點C堿基可能成為潛在篩選培育高產(chǎn)絨的絨山羊的參考標(biāo)準(zhǔn)［5］。但是，目前關(guān)于KAP9.2基因如何調(diào)控毛囊細(xì)胞生長發(fā)育的機(jī)制尚未見報道。因此，為了進(jìn)一步研究羊絨周期性生長過程中KAP9.2基因的功能，需要構(gòu)建KAP9.2過表達(dá)載體。

本試驗選擇腺病毒系統(tǒng)來構(gòu)建KAP9.2過表達(dá)載體，是考慮到相對于其它轉(zhuǎn)染媒介腺病毒具有高感染效率，既可以感染非分裂期細(xì)胞，也可以感染分裂期細(xì)胞，同時屬于瞬時感染，不存在基因整合風(fēng)險，低細(xì)胞毒性，減少病毒蛋白表達(dá)引起的細(xì)胞自身免疫反應(yīng)，相對于慢病毒其安全性更好，是一種理想的媒介［16］。Mizuguchi等［17］在1998年為優(yōu)化傳統(tǒng)腺病毒重組系統(tǒng)而構(gòu)建了AdEasyTM系統(tǒng)，采用該系統(tǒng)僅需兩步就可以獲得重組腺病毒［18－21］。本研究采用該系統(tǒng)順利完成了整個KAP9.2重組腺病毒包裝試驗。病毒滴度測定采用了由江千里等建立的“批量快速病毒滴度測定法（LaSRT）”［6－7］，該方法簡單實用，能夠?qū)崿F(xiàn)快速準(zhǔn)確計算出病毒滴度?？傊?，為研究KAP9.2基因在羊絨周期性生長中的功能，我們以陜北白絨山羊為研究對象，提取皮膚基因組，設(shè)計引物擴(kuò)增KAP9.2基因，構(gòu)建重組腺病毒載體并包裝擴(kuò)增KAP9.2重組腺病毒，獲得了1.34× 108GFU／mL高滴度的病毒顆粒，為在細(xì)胞水平研究KAP9.2基因功能提供了支持材料。

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