孫敬敬劉慧慧周世權(quán)王信超范美華申 望廖 智

(1. 浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院, 海洋生物資源及分子工程實(shí)驗(yàn)室, 舟山 316004; 2. 舟山醫(yī)院-中科院北京基因組研究所免疫基因組學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 舟山 316004)

一種新型貽貝抗菌肽的分離純化及鑒定

孫敬敬1劉慧慧1周世權(quán)2王信超1范美華1申 望1廖 智1

(1. 浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院, 海洋生物資源及分子工程實(shí)驗(yàn)室, 舟山 316004; 2. 舟山醫(yī)院-中科院北京基因組研究所免疫基因組學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 舟山 316004)

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)廣泛分布于我國東部海域, 其體內(nèi)富含各種抗菌肽分子, 是研究軟體動物免疫防御機(jī)制以及開發(fā)抗菌肽來源的新型生物抗生素的重要對象。采用多步反相高效液相色譜對厚殼貽貝血清進(jìn)行分離純化, 獲得一種分子量為6261.55 D的具有抗菌活性的多肽成分; 經(jīng)多肽N端測序和基因克隆,結(jié)果表明該抗菌肽由55個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成, 含6個(gè)半胱氨酸并形成三對二硫鍵。結(jié)構(gòu)域分析表明該抗菌肽具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Chitin-biding domain), 因此將該抗菌肽命名為mytichitin-A。Mytichitin-A對革蘭氏陽性菌具有較強(qiáng)的抑制作用, 同時(shí)對真菌及革蘭氏陰性菌也具有抑制作用。熒光定量 PCR檢測表明, mytichitin-A主要在厚殼貽貝的性腺組織中表達(dá)且在細(xì)菌誘導(dǎo)后12h其表達(dá)量達(dá)到峰值。研究為深入了解厚殼貽貝抗菌肽的分子多樣性及免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

厚殼貽貝; 抗菌肽; 幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域; 熒光定量PCR

抗菌肽是一類具有抗菌活性的多肽類分子,分子量通常小于10 kD, 由20—60個(gè)氨基酸殘基組成[1,2]?？咕氖巧锏钟饨绛h(huán)境微生物的入侵的重要手段, 也是目前新型生物抗生素研發(fā)的候選分子。目前, 人們分別從植物[3]、無脊椎動物[4]和脊椎動物[5]的不同類型組織和細(xì)胞中分離到為數(shù)眾多的抗菌肽, 通過模擬天然抗菌肽結(jié)構(gòu)的人工設(shè)計(jì)和改造的抗菌肽更是不計(jì)其數(shù)。目前, 在美國國家生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中, 以“抗菌肽”作為關(guān)鍵詞所搜索到的序列數(shù)總計(jì)達(dá)到16萬余條, 包括天然蛋白質(zhì)及其前體基因序列, 以及人工合成的抗菌肽序列等。生物中廣泛存在的抗菌肽分子也表明了抗菌肽作為先天免疫的效應(yīng)因子在生物體免疫系統(tǒng)中有著至關(guān)重要的作用[6,7]。

海洋生物由于其所處水環(huán)境的微生物多樣性和復(fù)雜性, 其體內(nèi)因此富含各種抗菌肽分子, 海洋生物抗菌肽研究在生物抗生素的研發(fā)中具有重要地位。貽貝屬于軟體動物門, 雙殼綱, 貽貝科; 貽貝缺乏特異性免疫系統(tǒng), 其免疫防御手段主要依賴于體內(nèi)各種類型的抗菌肽分子。貽貝抗菌肽歷來是海洋生物抗菌肽研究中的一個(gè)重要對象, 也是目前海洋生物抗菌肽研究中發(fā)現(xiàn)抗菌肽家族種類最多的物種之一。目前已報(bào)道的貽貝抗菌肽蛋白序列和基因序列可歸納為7個(gè)家族, 超過100個(gè)成員, 主要來自地中海貽貝(Mytilus galloprovincialis)、紫貽貝(Mytilus edulis), 以及加利福尼亞貽貝(Mytilus californianus)等。貽貝抗菌肽家族主要包括Mytilin (包括Mytilin A, B, C, D和G1)[8]、Mytimycin[8]、MGD(包括MGD-1和MGD-2)[9—11]、Myticin (myticin A, B, C)[12]、Myticusin[13]、big defencin 和 mytimacin[14]。上述貽貝的不同抗菌肽家族成員具有各自不同的抗菌譜,例如MGD與Myticin A主要對革蘭氏陽性菌以及對蝦白斑病毒等有強(qiáng)的殺菌活性, 對革蘭氏陰性菌和真菌的抑制作用較弱[10—12]; Mytimycin則具有較強(qiáng)的抗真菌活性[8]; Mytilin B、C、D則對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的有效抑菌濃度無明顯區(qū)別; 而Mytilin G1則只對革蘭氏陽性菌具有抗菌活性; 此外, Mytilin B、D以及Myticin B還具有強(qiáng)的抗真菌活性[13]。貽貝抗菌肽的分子多樣性特征表明, 貽貝可組合利用不同的抗菌肽分子以抵御外界不同的微生物侵襲[15,16]。

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)廣泛分布于我國東部海域, 具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在前期研究中, 我們通過多維色譜方法結(jié)合抗菌活性檢測和質(zhì)譜鑒定,從其血淋巴中鑒定到厚殼貽貝中一種分子量超過10000 D 的新型抗菌肽 myticusin-1[13]以及三種Mytilin家族抗菌肽成分[17]。本研究通過高效液相色譜結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)和微量蛋白質(zhì)測序, 獲得一種此前尚未報(bào)道過的新型抗菌肽分子并克隆了其全長cDNA基因, 因其序列中含有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Chitin-biding domains), 我們將該新型抗菌肽分子命名為 mytichitin-A; 該新型抗菌肽對多種革蘭氏陽性菌、陰性菌和真菌均具有較強(qiáng)的抑制活性; 熒光定量PCR分析表明, mytichtin-A主要在性腺組織表達(dá), 經(jīng)剪切后其成熟肽釋放至血清以發(fā)揮抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

成年厚殼貽貝(M. coruscus)采自浙江舟山東極島海域, 以潔凈海水在通氧條件下飼養(yǎng)于恒溫水族箱(18—20 )℃。

所用細(xì)菌和真菌購自北京中國普通微生物菌種保藏管理中心; 三氟乙酸(TFA)、α-氰基-4-羥基-肉桂酸(CCA)為Sigma公司產(chǎn)品; 蛋白質(zhì)N端測序試劑為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品;乙腈(色譜純)為美國TEDIA公司產(chǎn)品; Taq酶為Ferments公司產(chǎn)品; dNTP、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、氨芐青霉素(Ampicillin)購自上海捷瑞公司; 其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。實(shí)驗(yàn)用去離子水由密理博(Millipore synergy)純水系統(tǒng)(法國 Millipore公司)制取。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

厚殼貽貝的誘導(dǎo)與血清的收集 厚殼貽貝血淋巴的采集參照參照文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行。以滅活的大腸桿菌在貽貝后閉殼肌處注射進(jìn)行誘導(dǎo), 誘導(dǎo) 24h后, 以內(nèi)含抗凝劑(Alsever溶液)的注射器從其后閉殼肌至圍心腔處抽取血淋巴; 4℃下立即離心(800 g, 15 min)以去除血細(xì)胞及其他不溶性雜質(zhì); 收集上清液, 以含0.1% TFA的去離子水按1∶1比例稀釋后,調(diào)pH至3.75, 在4℃攪拌20 min后再次離心(4 , ℃10000 g, 20 min), 上清于–20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

抗菌肽的分離純化 采用Waters 600E型高效液相色譜對厚殼貽貝血清進(jìn)行分離純化, 檢測器為Waters 2487型紫外檢測器, 采用雙波長檢測(280和254 nm)。

采用美國 Waters公司 SunfireTMPrep C8(10× 250 mm)半制備反相色譜柱進(jìn)行分離。洗脫液分別為含0.1%TFA的去離子水(A液)和含0.1%TFA的乙腈(B液); 線性梯度洗脫(20分鐘內(nèi)乙腈濃度從 5%上升至60%); 流速3 mL/min, 分別收集洗脫液, 冷凍干燥后進(jìn)行抗菌活性檢測; 對上述步驟中具有抗菌活性的洗脫峰組分采用218TP54 C18(4.6×250 mm, Vydac公司)分析型反相色譜柱進(jìn)行進(jìn)一步反相高效液相色譜分離, 洗脫液分別為去離子水(A液, 含0.1%TFA)和乙腈(B液, 含 0.1%TFA); 線性梯度洗脫方式, B液比例在50min內(nèi)從20%上升至40%, 流速0.75 mL/min, 收集各洗脫峰經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行抗菌活性檢測。

抗菌活性檢測 參照文獻(xiàn)[9]方法, 采用酶標(biāo)儀(MK3型, 美國熱電公司)結(jié)合細(xì)菌生長曲線抑制法(Liquid growth inhibition assay)檢測抗菌肽的抗菌活性。其中, 革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃蝶球菌(Sarcina luteus),巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis); 革蘭氏陰性菌為大腸桿菌(Escherichia coli)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi); 真菌為白色念球菌(Candida albicans)和白假絲酵母(Monilia albican)。菌種于基礎(chǔ)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)質(zhì)菌體濃度達(dá)A600=0.001。取90 μL懸浮菌液與10 μL樣品溶液混合, 抗菌肽樣品事先溶于培養(yǎng)基中, 經(jīng)倍比稀釋后分別加入至懸浮菌液中并置于于96孔板; 30℃條件下孵育12h后在酶標(biāo)儀上測定A600。根據(jù)A600值判斷細(xì)菌的生長狀況; 最終確定最小抑菌濃度范圍(MIC)。MIC值用(a–b)形式表示, 其中(a)表示細(xì)菌能正常生長的最高樣品濃度; (b)表示完全抑制細(xì)菌生長所需樣品的最低濃度。

質(zhì)譜分析 利用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)鑒定蛋白質(zhì)的精確分子量,質(zhì)譜儀為美國 Applied Biosystems公司的 Voyager-DE? STR Biospectromitry? 質(zhì)譜工作站。N2光源337 nm; 離子加速電壓為20000 V, 采用線性陽離子模式檢測, 所用基質(zhì)為CCA。通過以下方式制備樣品: 首先將CCA溶于含 0.1%TFA的50%乙腈溶液中至過飽和, 取1 μL 樣品液加入到9 μL CCA溶液,混勻后取1 μL點(diǎn)樣, 室溫干燥后測定, 并采用內(nèi)標(biāo)法校正分子量。

氨基酸序列分析 蛋白質(zhì)氨基酸序列測定采用N-端Edman降解法在美國Applied Biosystems公司的491-A型氣相測序儀上完成。參照儀器說明書以標(biāo)準(zhǔn)程序測序, 測32個(gè)循環(huán), 在線反相高效液相色譜分離氨基酸, 結(jié)合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜判斷氨基酸種類, 最終準(zhǔn)確讀出所測樣品的氨基酸序列。

通過 http://www.expasy.org/tools/#primary在線分析蛋白質(zhì)的理論分子量和等電點(diǎn); 通過 http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進(jìn)行序列搜索與比對;結(jié)構(gòu)域分析利用SMART軟件在線進(jìn)行(http://smart. embl-heidelberg.de/); 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SWISS-Model軟件在線(http://swissmodel.expasy. org/ )進(jìn)行[18]。

基因克隆 將mytichitin-A已知的N端31個(gè)氨基酸殘基的序列采用tblastn工具搜索NCBI網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)的貽貝(Mytilus)EST文庫, 獲得與其完全匹配的 EST序列(數(shù)據(jù)庫編號: gb|ES407161.1|), 該EST序列來自加利福尼亞貽貝。結(jié)合該EST序列以及mytichitin-A的N端部分氨基酸序列, 設(shè)計(jì)兩條特異性上游引物(Mytichitin-F-1: 5′-TACCAAGACCAACAACTACA-3′; Mytichitin-F-2: 5′-CCTAAAATGTGGCATGAATGG-3′); PCR反應(yīng)所用下游引物分別試劑盒所帶引物, 分別為3′RACE-R1 (5′-GTTTTCCCAGTCACGACTTTTTTT TTTTTTT-3′) 和3′RACE-R2(5′-GTTTTCCCAGTCAC GAC-3′)。以厚殼貽貝性腺組織總 RNA為模板, 采用Takara公司的3′-RACE試劑盒, 按照其說明書進(jìn)行操作, 采用兩步法克隆mytichitin-A的3′端cDNA序列。

根據(jù)上述步驟中克隆到的mytichitin-A的3′端cDNA基因序列, 設(shè)計(jì)特異性下游引物(5′-RACE-R: 5′-GTTCTCAATCTAATATTCCAAAGTCA-3′), 采用北京全式金公司的RACE試劑盒(SUPERSWITCH? RACE cDNA Synthesis Kit)進(jìn)行5′-RACE擴(kuò)增, 操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行, 以試劑盒自帶的5′-RACE上游接頭引物和mytichitin特異性引物5′-RACE-R配對進(jìn)行mytichitin的5′-端cDNA基因的擴(kuò)增。將3′-RACE和5′-RACE獲得的序列進(jìn)行拼接,從而獲得mytichitin-A的cDNA全序列。

2 結(jié)果

2.1 厚殼貽貝新型抗菌肽mytichitin-A的分離純化

厚殼貽貝血淋巴經(jīng)半制備型C8柱反相分離后,洗脫圖譜見圖1A。其洗脫峰主要集中在乙腈濃度為20%—35%的區(qū)域。以每兩分鐘收集一管洗脫液, 經(jīng)抗菌活性測試, 發(fā)現(xiàn)在乙腈濃度 28%—30%時(shí)(圖1A中星號標(biāo)注)洗脫的成分具有較強(qiáng)的抗菌活性;收集該部分洗脫液, 進(jìn)一步以分析型C18反相柱進(jìn)行分離, 收集各洗脫峰進(jìn)行抗菌活性測試, 結(jié)果表明, 乙腈濃度為25%時(shí)的洗脫成分(圖1B星號標(biāo)注)具有較強(qiáng)抗菌活性; 質(zhì)譜分析表明, 該成分純度較高, 其單同位素峰分子量為6261.55 D (圖1C); 收集該成分進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸序列測定, 獲得其N端31個(gè)氨基酸殘基的序列(圖1C)。

2.2 Mytichitin-A的序列分析

根據(jù)mytichitin-A 已測得的N端31個(gè)氨基酸殘基序列, 設(shè)計(jì)特異性引物, 采用 3′-RACE方法, 獲得其3′端cDNA基因序列, 由此推導(dǎo)出mytichitin-A的C端完整的氨基酸序列。進(jìn)一步通過5′-RACE技術(shù)獲得mytichitin-A的5′-端cDNA基因序列。經(jīng)序列拼接后, 我們發(fā)現(xiàn), 所克隆到的 mytichitin-A 的cDNA序列由1558個(gè)核苷酸組成, 包括3′端的多聚A序列 (Genebank編號: KF675770); 其加尾信號(AATAAA)位于多聚腺苷酸上游15個(gè)核苷酸處; 其開放閱讀框編碼一條446個(gè)氨基酸殘基組成的前體肽; 其中, 信號肽由N端25個(gè)氨基酸殘基組成; 成熟肽區(qū)C端55個(gè)氨基酸殘基為mytichitin-A抗菌肽,其中N端31個(gè)氨基酸殘基的序列與蛋白質(zhì)測序儀測定的序列完全一致, 表明基因克隆是成功的。mytichitin-A的序列中含有10個(gè)堿性氨基酸(Arg和Lys)以及 3個(gè)酸性氨基酸(Asp), 是一種典型的陽離子抗菌肽, 其等電點(diǎn)為9.18; mytichitin-A的序列中含 6個(gè)半胱氨酸, 其半胱氨酸分布模式為 C-X7-CX9-C-X7-C-X9-C-X11-C(X代表非半胱氨酸, C代表半胱氨酸, 數(shù)字代表氨基酸數(shù)目); 結(jié)構(gòu)域分析表明, mytichitin-A序列中第17到第55個(gè)氨基酸殘基為幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(chitin-biding domain); 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明, mytichitin-A的三維結(jié)構(gòu)主要包含四段反平行β-折疊(圖2)。 2.3 Mytichitin-A的抗菌活性

圖1 厚殼貽貝血清反相高效液相色譜分離圖譜Fig. 1 M. coruscus serum separated by RP-HPLC

Mytichitin-A抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表1。Mytichitin-A對革蘭氏陽性菌有明顯的抑制作用, 其最低抑制濃度(MIC)低于5 μmol/L; 對革蘭氏陰性菌的抑制作用較弱, 其MIC值在25 μmol/L以上; 此外, mytichitin對于真菌也具有一定的抑制作用。2.4 Mytichitin-A的表達(dá)分析

通過熒光定量PCR技術(shù)分析了Mytichitin基因在厚殼貽貝血細(xì)胞、消化腺、外套膜、后閉殼肌、物抗菌肽研究的重要對象之一。由于貽貝生存的水環(huán)境具有極為復(fù)雜的微生物體系, 同時(shí)貽貝又不具備后天免疫系統(tǒng), 因此, 抗菌肽對于貽貝的生存極為重要。當(dāng)前, 已經(jīng)從貽貝體內(nèi)鑒定的抗菌肽種類主要包括從血淋巴中分離到的 mytilin、MGD、myticin、mytimycin等4大家族[15]; 此外, Macro, et al.采用RNA深度測序技術(shù)從地中海貽貝的外套膜、消化腺、腮等組織中克隆到大防御素(Big defencin)以及 mytimacin兩類抗菌肽家族的基因[14]; 本實(shí)驗(yàn)室在前期從厚殼貽貝血細(xì)胞中鑒定到一種分子量超過10000 D的抗菌肽myticusin-1[13]。上述研究表明, 貽貝體內(nèi)的抗菌肽呈現(xiàn)明顯的分子多樣性。

通過多步高效液相色譜結(jié)合抗菌活性測試, 我們從厚殼貽貝血淋巴中分離到一種新型抗菌肽分子,命名為 mytichitin-A。通過 Edman降解獲得了該抗菌肽的 N端序列; 通過 3′RACE技術(shù)獲得其 3′端cDNA序列, 由此推導(dǎo)出其蛋白質(zhì) C端序列; 最終獲得mytichitin-A的蛋白質(zhì)全序列。mytichitin-A的理論分子量為 6273.37 D, 其質(zhì)譜測試的精確分子量為 6261.55 D, 兩者相差 12 D, 該結(jié)果表明mytichitin-A的6個(gè)半胱氨酸參與形成了3對二硫鍵,但其二硫鍵配對方式需進(jìn)一步研究。目前已報(bào)道的貽貝抗菌肽均含有數(shù)目不等的半胱氨酸并形成多對二硫鍵, 例如, mytilin、myticin和MGD抗菌肽均含有8個(gè)半胱氨酸, 形成4對二硫鍵[15]; mytimycin含有12個(gè)半胱氨酸, 形成6對二硫鍵[19]; myticusin-1含有10個(gè)半胱氨酸, 形成5對二硫鍵[13]。從二硫鍵數(shù)目以及序列特征來看, mytichitin-A與上述貽貝抗菌肽具有明顯差別, 是一種新型的貽貝抗菌肽分子。值得注意的是, Mytichitin-A的cDNA 序列所編碼的前體蛋白序列長度為 446個(gè)氨基酸殘基, 經(jīng)signalIP4.1程序在線(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)分析, 其前體肽N端25個(gè)殘基為典型的信號肽序列; 通過 NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索發(fā)現(xiàn)mytichitin-A 的前體肽與數(shù)據(jù)庫中的同源序列多為幾丁質(zhì)酶家族成員; 在抗菌肽數(shù)據(jù)庫(http://aps. unmc.edu/AP/database)中進(jìn)行搜索時(shí), mytichitin-A成熟肽序列未能搜索到任何同源序列; 同時(shí)未發(fā)現(xiàn)有幾丁質(zhì)酶家族成員的蛋白質(zhì)序列有經(jīng)過剪切,其 C端部分獨(dú)立具備抗菌肽活性的報(bào)道, 這表明mytichitin-A是一種新型的抗菌肽分子, 且其分泌機(jī)制與已知抗菌肽分子存在較大差異; 我們推測, mytichitin-A是其前體肽通過某種蛋白剪切機(jī)制, 其C端55個(gè)氨基酸殘基所在肽段具備抗菌活性并分泌至血清中發(fā)揮免疫防御作用。但是, mytichitin-A的剪切是發(fā)生在性腺細(xì)胞內(nèi)還是血淋巴中尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。同時(shí), 經(jīng)過結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)mytichitin-A的序列中所含幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Chitin binding peritrophin-A domain, pfam編號: pfam01607, 屬于peritrophin-A家族類型 ), 該結(jié)構(gòu)域通常含有6個(gè)半胱氨酸并形成 3對二硫鍵, 最早發(fā)現(xiàn)于昆蟲腸道圍食膜蛋白peritrophin[20,21]。幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域參與蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)的結(jié)合。目前, 關(guān)于具有該結(jié)構(gòu)域的抗菌肽分子報(bào)道并不多見, 少數(shù)已報(bào)道的具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗菌肽分子主要來自甲殼類動物[22]以及莧屬植物[23]。例如, 最早發(fā)現(xiàn)具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗菌肽是 Kawabata et al.報(bào)道的, 來自馬蹄蟹(Tachypleus tridentatus)血細(xì)胞的Tachycitin[24]。這是一種由 73個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的抗菌肽, 包含10個(gè)半胱氨酸并形成5對二硫鍵; Tachycitin的N端序列具有典型的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 同時(shí)Tachycitin本身也具有幾丁質(zhì)結(jié)合的活性[24]; 此外, 從南美白對蝦(Penaeus vannamei)中分離到的抗菌肽penaeidins(47—63個(gè)氨基酸組成, 含3對二硫鍵)也是一種具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗菌肽分子, 既具有抗菌活性, 也具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性[25]。上述具有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗菌肽分子均具有較強(qiáng)的抗真菌活性, 同時(shí), 其幾丁質(zhì)結(jié)合活性推測可能與甲殼類動物體表的損傷修復(fù)有關(guān)。Mytichitin-A在體外抑菌試驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的抑菌活性, 特別是對革蘭氏陽性菌的活性較強(qiáng), 同時(shí)對真菌也具有較強(qiáng)的抑制作用。但 mytichitin-A的幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與其生物學(xué)功能之間的關(guān)聯(lián)尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。同時(shí),對myticitin-1的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明, myticitin-1的空間結(jié)構(gòu)以反平行β-折疊為主(圖4); 而同樣含有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗菌肽 Tachycitin的三維結(jié)構(gòu)也以 5段反平行 β-折疊為主[26]。盡管 mytichitin-A與Tachycitin的序列相似性并不大(僅22%), 但兩者的空間結(jié)構(gòu)類似, 推測與兩者具有類似的生物學(xué)活性有關(guān)。將 mytichitin-A 的 cDNA 序列經(jīng)貽貝(Mytilus)的EST庫搜索, 發(fā)現(xiàn)在加利福尼亞貽貝(M. californianus)、地中海貽貝(M. galloprovincialis)以及紫貽貝(M. edulis)的 EST 序列中均存在與mytichitin-A高度同源的EST序列(數(shù)據(jù)未展示); 綜合上述結(jié)果, 作為一種新穎的抗菌肽分子, mytichitin類似的分子至少在貽貝屬中廣泛存在, 而且是一種在貽貝屬中較為保守的抗菌肽分子。

值得注意的是, 多數(shù)水生生物的抗菌肽的表達(dá)部位通常位于皮膚[27]或者血細(xì)胞等相關(guān)組織。例如,貽貝抗菌肽的主要表達(dá)組織為其血細(xì)胞, 其中mytilin、myticin、MGD等抗菌肽均由貽貝血淋巴腫的顆粒細(xì)胞表達(dá), 翻譯后的抗菌肽分子或儲存于血細(xì)胞, 或分泌至血淋巴中隨著血液循環(huán)在全身各組織發(fā)揮防御作用[10]。而 Mytichitin-A主要在性腺組織表達(dá)。盡管 mytichitin-A抗菌肽是從貽貝血淋巴中通過分離純化獲得, 但是其基因表達(dá)量最高的組織是性腺(且在雄性和雌性貽貝個(gè)體中無明顯表達(dá)差異), 其次是消化腺, 在性腺中的表達(dá)量較消化腺高出約150倍; 而血細(xì)胞中并未檢測到mytichitin-A的表達(dá)。此外, mytichitin-A在性腺組織的表達(dá)受細(xì)菌誘導(dǎo)的影響, 在貽貝經(jīng)滅活細(xì)菌誘導(dǎo) 12h后, mytichitin-A在性腺組織的表達(dá)量達(dá)到峰值, 其表達(dá)量較誘導(dǎo)前升高近9倍。在誘導(dǎo)24h后, mytichitin-A的表達(dá)恢復(fù)到本底水平。綜合以上數(shù)據(jù), mytichitin-A是一種主要由貽貝的性腺組織表達(dá)的, 含有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的新型抗菌肽分子, 其前體肽經(jīng)酶解后, 成熟肽部分通過未知途徑分泌入血, 由血液循環(huán)送至全身各個(gè)組織發(fā)揮抗菌活性。上述研究為進(jìn)一步了解貽貝的免疫防御機(jī)制以及開發(fā) mytichitin-A來源的生物抗生素奠定了基礎(chǔ)。

致謝:

感謝湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)研究室的胡衛(wèi)軍博士提供了質(zhì)譜檢測和蛋白質(zhì)N端測序結(jié)果。

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A NOVEL ANTIMICROBIAL PEPTIDE IDENTIFIED FROM MYTILUS CORUSCUS

SUN Jing-Jing1, LIU Hui-Hui1, ZHOU Shi-Quan2, WANG Xin-Chao1, FAN Mei-Hua1, SHEN Wang1and LIAO Zhi1
(1. Laboratory of Marine Living and Molecular Engineering, College of Marine Science, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316004, China; 2. Joint Laboratory of Immunogenomics, Zhoushan Hospital-BIG/CAS, Zhoushan Hospital, Zhoushan 316004, China)

The researches on antibacterial peptides from Mytilus coruscus, an important mytilus on aquiculture, have significant value that helping people to understand the mechanism of innate immune system of this mussel. By using multi-dimensional reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), a novel antimicrobial peptide was isolated from Mytilus coruscus serum. The mass and the N-terminal sequence of this peptide were analyzed by a combination of Mass Spectrometry and Edman degradation. This peptide consisted 55 amino acids and had a 6621.55 D with 6 Cysteines presented in its sequence forming 3 disulfide bonds. A chitin-biding domain was detected by domain analysis and the peptide was named mytichitin-A therefore. The mRNA transcripts of mytichitin-A were mainly detected in gonad, which indicated that mytichitin-A were specifically synthesized and stored in genital system. The expression level of mytichitin-A in gonad was up-regulated and reached to the highest level at 12h after bacterial challenge, which was 9-fold increase compared to that of the control group. These results indicated that mytichitin-A was involved in the host immune response against bacterial infection and might contribute to the clearance of invading bacteria.

Mytilus coruscus; Antibacterial peptide; Chitin-biding domain; RT-PCR

Q936

A

1000-3207(2014)03-0563-08

10.7541/2014.79

2013-09-27;

2013-12-26

浙江省科技廳面上科研農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2009C32016)資助

孫敬敬(1986—), 女, 山東濟(jì)寧人; 碩士研究生; 主要研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)與功能。E-mail: 451346219@qq.com

廖智(1973—), 男, 湖南長沙人; 博士; 主要研究方向?yàn)榛钚远嚯牡慕Y(jié)構(gòu)與功能。E-mail: liaozhi@zjou.edu.cn