蘭 云 胡秀彩 呂愛軍 沈曉靜 朱愛華 馮照軍

(江蘇師范大學生命科學學院, 徐州221116)

黃喉擬水龜摩氏摩根菌的分離鑒定及藥敏試驗

蘭 云 胡秀彩 呂愛軍 沈曉靜 朱愛華 馮照軍

(江蘇師范大學生命科學學院, 徐州221116)

黃喉擬水龜(Mauremys mutica), 俗稱石龜、石金錢龜、黃板龜?shù)? 為龜科擬水龜屬, 主要分布于中國江蘇、安徽、福建以及越南、日本等。黃喉擬水龜具有食用、藥用和觀賞價值, 近年來野生資源日趨減少, 人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速。細菌性病原感染是黃喉擬水龜養(yǎng)殖過程中常見疾病, 目前已報道黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)[1]、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)[2]、摩氏摩根菌(Morganella morganii)[3]、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophmomas maltophilia)和腦膜炎膿毒性黃桿菌(Flavobacterium meningosepticum)[4]等可引起黃喉擬水龜感染發(fā)病。

2013年3—4月, 江蘇省徐州市某養(yǎng)殖場暴發(fā)黃喉擬水龜細菌性慢性傳染病, 病龜臨床表現(xiàn)為頭肢部潰爛、蛻皮, 爪脫落, 眼睛感染嚴重以致失明, 行動遲緩、食欲廢絕, 有濃重腥臭味, 引起零星死亡。為確定該病病原菌,通過細菌分離鑒定、生化特性及16S rDNA序列分析以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等方法進行系統(tǒng)鑒定。本文進行摩氏摩根菌的分離鑒定、藥敏試驗及動物感染試驗等研究, 以期為黃喉擬水龜細菌性疾病的診斷與防治提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物及癥狀觀察 江蘇省徐州市某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的黃喉擬水龜發(fā)生細菌性感染疾病, 導致病龜零星死亡, 以發(fā)病黃喉擬水龜為試驗動物, 并觀察記錄病龜癥狀。健康稚龜購自徐州市某花鳥市場, 體重約為8.5 g, 體長約4.5 cm。

試驗試劑 LB培養(yǎng)基、細菌生化鑒定管和藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司; PCR反應試劑2×Taq PCR MasterMix購自南京諾唯贊生物科技有限公司, 細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司; 受體菌 DH5α由實驗室保存; DNA Marker、pMD18-T克隆載體購自TaKaRa公司; 引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

病原菌分離與純化 參考李楠等方法進行[5], 病龜體表病灶用無菌生理鹽水沖洗, 取病灶組織劃線接種于LB培養(yǎng)基, 29℃恒溫培養(yǎng)24h; 無菌操作從肝臟、心臟取樣, 劃線接種于LB培養(yǎng)基, 29℃恒溫培養(yǎng)24h。挑取典型單菌落分離純化, 獲得純種后進行革蘭氏染色鏡檢,并接種于試管斜面保存、備用。

細菌生理生化及藥敏試驗 參考譚愛萍等方法進行[6], 無菌操作挑取適量細菌接種于細菌生化鑒定管, 29℃恒溫培養(yǎng)48h, 觀察記錄結(jié)果。采用K-B法進行藥敏試驗, 選用24種抗生素對3株細菌進行藥敏試驗, 29℃培養(yǎng)24h, 測量各種藥物的抑菌圈直徑, 多次測量取平均值,以判定藥物對細菌的抑制作用。

16S rDNA基因克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌總DNA, 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測, －20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ钥侱NA為模板,采用細菌通用引物進行 16S rDNA基因擴增, 正向引物F27: AGTTTGATCATGGCTCAG, 反向引物R1492: GTTA CCTTGTTACGACTT。PCR體系: 2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL, 上、下游引物各1 μL, DNA模板1 μL, ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件: 94℃預變性4min、94℃變性40s、55℃復性 40s、72℃延伸 1min, 35個循環(huán)后 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物與pMDl8-T載體連接, 轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α, 篩選陽性克隆, 送上海生工生物工程有限公司測序。分離菌16S rDNA序列通過BLAST和Clustalx l.83軟件進行16S rDNA序列比對分析, 采用MEGA.4軟件鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

動物感染試驗 將3株分離菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基29℃培養(yǎng)12h, 取0.5 mL菌液倍比稀釋, 傾注平板法測定菌液濃度, 用生理鹽水稀釋至 1.0×109cfu/mL和1.0×108cfu/mL。稚龜感染試驗采用腹腔注射法, 每只稚龜注射菌液 0.1 mL, 對照組注射 0.1 mL無菌生理鹽水;飼養(yǎng)溫度約為25 , ℃ 連續(xù)觀察15d、記錄實驗結(jié)果。同時對發(fā)病死亡的稚龜進行細菌再分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 病龜癥狀及病原菌分離

2013年3—4月, 徐州某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的黃喉擬水龜發(fā)病, 臨床癥狀主要表現(xiàn)為慢性感染(圖 1): 頭部、四肢、尾部及甲殼邊緣部皮膚潰爛, 皮膚組織變白、蛻皮, 有嚴重的腥臭味; 進一步感染頸部潰爛穿孔, 四肢肌肉、骨骼外露, 爪脫落, 導致零星死亡; 病理解剖可見病龜心臟、肝臟腫大, 肝臟呈暗黑色。

圖1 黃喉擬水龜體表癥狀(箭頭為病灶處)Fig. 1 The clinical signs of Mauremys mutica (arrows indicate local lesions)

從黃喉擬水龜病灶處分離得到 1株細菌, 編號為TMM13032; 從心臟、肝臟中各得到1株細菌, 分別編號為TMM13033、TMM13034。3株分離菌在LB培養(yǎng)基上生長良好, 29℃培養(yǎng)24h后菌落均呈乳白色、半透明、中間凸起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊; 3株細菌均為革蘭氏染色陰性, 直桿菌(圖2)。

圖2 TMM13033菌株的菌落及菌體形態(tài)Fig. 2 The individual cell and colonies morphologic characteristics of the TMM13033 strain

2.2 生理生化特性

選用35項細菌生化編碼鑒定管對分離菌進行生化特性檢測, 結(jié)果表明TMM13032、TMM13033、TMM13034菌株的生理生化特性基本一致, 能利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,有運動性, 發(fā)酵型, MR試驗、枸櫞酸鹽、脲酶、鳥氨酸、ONPG、硝酸鹽還原和DNA酶試驗均為陽性(表1)。以上3株分離菌的培養(yǎng)特性、生理生化特性, 基本符合《伯杰細菌鑒定手冊》描述的摩根菌屬(Morganella)特征[7]。

圖3 三株分離菌的基因組DNA及16S rDNA的PCR擴增結(jié)果Fig. 3 The results of genomic DNA and 16S rDNA PCR amplification of the three strains

2.3 菌株16S rDNA基因擴增、測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以3株分離菌基因組DNA為模板, 采用PCR方法擴增其16S rDNA序列, 電泳檢測在1500 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖3), 測序獲得 TMM13032、TMM13033、TMM13034菌株16S rDNA片段大小分別為1506、1507、1507 bp, 序列遞交至 GenBank數(shù)據(jù)庫的登錄號分別為KF611894、KF611895、KF611896。將16S rDNA序列通過 Blast軟件進行序列同源性檢索, TMM13032、TMM13033、TMM13034菌株與摩氏摩根菌(Morganellamorganii)模式株ATCC25830(登錄號: AJ301681)同源性分別為98.93%、99.67%、99.07%; 選擇14個標準菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, TMM13032、TMM13033、TMM13034與摩氏摩根菌(M. morganii)自然聚為一支(圖4), 結(jié)合3株分離菌的理化特征, 鑒定均為摩氏摩根菌。

2.4 動物感染及藥敏試驗結(jié)果

動物感染試驗分別以菌液濃度為108、109cfu/mL感染稚龜, 結(jié)果表明3株摩氏摩根菌感染2d后出現(xiàn)精神萎。頓、行動遲緩、食欲不振, 個別眼睛有分泌物等癥狀, 感染 3d后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象, 死亡率為 33.3%—66.7% (表 2),并且從死亡龜中重新分離獲得摩氏摩根菌; 對照組稚龜均未發(fā)病死亡。

選用24種抗生素進行藥敏試驗, 結(jié)果顯示3株分離菌對哌拉西林、頭孢哌酮、丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素、乙基西梭霉素、諾氟沙星7種抗生素敏感, 對氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢孟多、替考拉寧、阿奇霉素、紅霉素、制菌霉素、四環(huán)素、萘啶酸、利福平、克林霉素、呋喃妥因、復方新諾明、潔霉素 14種抗生素耐藥; 此外, 病灶分離株TMM13032對氯霉素、磺胺異惡唑、甲氧芐啶3種抗生素敏感, 而TMM13033、TMM13034菌株耐藥(表3)。

表1 三株分離菌株的生化反應結(jié)果Tab. 1 The biochemical reaction results of the three isolates

表2 三株分離菌的動物感染試驗結(jié)果Tab. 2 Results of animal infection test of the three isolates

3 討論

摩氏摩根菌(Morganella morganii)為腸桿菌科細菌,廣泛分布于水、土壤及人和動物糞便中, 是引起嚴重感染的條件致病菌之一, 主要引起人尿路感染和術(shù)后傷口感染。目前, 關(guān)于摩氏摩根菌對水生動物的致病機制研究,尚未見相關(guān)文獻報道。Chen等從術(shù)后感染敗血癥病人血液中分離到摩氏摩根菌[8]。Zhao等從病雞肝臟組織及分泌物中分離病原菌, 通過生化特性、16S rDNA序列分析確定為摩氏摩根菌[9]。趙耘等從患病袋鼠肺臟中分離到3株摩氏摩根菌, 其 16S rDNA 基因序列與模式株LMG7874同源性為 99.8%[10]。研究表明, 摩氏摩根菌可引起多種養(yǎng)殖水生動物感染發(fā)病, 是水生動物重要病原菌之一?？桌俚葟闹腥A鱉癤瘡病灶及內(nèi)臟中分離到摩氏摩根菌, 通過稚鱉感染試驗證實該菌具有較強致病性[11]。黎小正等從發(fā)病黃喉擬水龜肝、肺中分離到摩氏摩根菌, 通過動物感染試驗確定為病原菌[3]。本研究從發(fā)病黃喉擬水龜體表及內(nèi)臟中分離到摩氏摩根菌(M. morganii), 這與摩氏摩根菌感染引起龜死亡的相關(guān)報道基本一致[3,11]。

近年來, 水生病原菌耐藥性不斷增強, 進一步增加了臨床治療難度。本試驗對分離菌進行藥敏試驗, 旨在篩選有效治療藥物, 結(jié)果顯示3株摩氏摩根菌對哌拉西林、頭孢哌酮、丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素等抗生素高度敏感?？桌俚冗M行中華鱉摩氏摩根菌藥敏試驗, 證實對氨曲南、氟苯尼考、頭孢哌酮等藥物敏感[11]。Zhao等發(fā)現(xiàn)雞源摩氏摩根菌對頭孢哌酮、新霉素、諾氟沙星、鏈霉素等抗生素敏感[9]。此外, 研究表明摩氏摩根菌對多種常用抗生素存在耐藥性, 因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中要慎選藥物、合理用藥, 其中頭孢哌酮、諾氟沙星等抗生素是治療摩氏摩根菌感染的首選藥物, 為水生動物細菌性疾病預防和治療提供科學參考。

圖4 三株分離菌的系統(tǒng)進化樹分析Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of the three isolates

[1] Tan A P, Zou W M, Jiang L. Identification of SG24 strain, a pathogenic bacteria causing ulceration of Mauremys mutica cantor [J]. Journal of Guangdong Ocean University, 2007, 27(3): 64—68 [譚愛萍, 鄒為民, 姜蘭. 黃喉擬水龜體表潰瘍病原菌 SG24的分類鑒定. 廣東海洋大學學報, 2007, 27(3): 64—68]

[2] Li X Z, Wei Z X, Tong G X, et al. Isolation, identification and medicine sensitivity test of Staphylococcus sciuri in turtle Mauremys mutica [J]. Journal of Dalian Fisheries University, 2009, 24(4): 371—374 [黎小正, 韋信賢, 童桂香,等. 黃喉擬水龜致病菌-松鼠葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗. 大連水產(chǎn)學院學報, 2009, 24(4): 371—374]

[3] Li X Z, Wei Z X, Tong G X, et al. Isolation, identification and phylogenetic analysis of Morganella morganii in Mauremys mutica Cantor [J]. Journal of Shanghai Ocean University, 2010, 19(3): 358—363 [黎小正, 韋信賢, 童桂香, 等. 黃喉擬水龜摩氏摩根菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析. 上海海洋大學學報, 2010, 19(3): 358—363]

[4] He W C, Jiang Q X, Song X Q, et al. Isolation and identification of the pathogen of “rotten shell” of Mauremys mutica (Cantor) [J]. Guangxi Journal of Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2006, 22(4): 167—168 [何成偉, 江其杏, 宋旭權(quán), 等. 黃喉擬水龜"腐殼病"的病原分離與鑒定. 廣西畜牧獸醫(yī), 2006, 22(4): 167—168]

[5] Li N, Guo H Z, Jiao R, et al. Identification and pathogenicity of bacterial pathogens isolated in an outbreak on bacterial disease of Ctenopharyngodon idellus [J]. Acta Hydrobio-logica Sinica, 2011, 35(6): 980—987 [李楠, 郭慧芝, 焦冉,等. 草魚的一種急性細菌性傳染病病原的分離鑒定及致病性研究. 水生生物學報, 2011, 35(6): 980—987]

[6] Tan A P, Deng Y T, Jiang L, et al. Isolation and identification of a multiple-drug resistant Klebsislla pneumoniae from Anguilla marmorata [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2013, 37(4): 744—750 [譚愛萍, 鄧玉婷, 姜蘭, 等. 一株多重耐藥鰻源肺炎克雷伯菌的分離鑒定. 水生生物學報, 2013, 37(4): 744—750]

[7] Noel R K, James T S, Daniel R B, et al. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Second Edition Volume Four [M]. Bergey’s Manual Trust. 2010, 105—245

[8] Chen Y T, Peng H L, Shia W C, et al. Whole-genome sequencing and identification of Morganella morganii KT pathogenicity-related genes [J]. BMC Genomics, 2012, 13(Suppl 7): S4

[9] Zhao C G, Tang N, Wu Y, et al. First reported fatal Morganella morganii infections in chickens [J]. Veteromary Microbiology, 2012, 156(3-4): 452—455

[10] Zhao Y, Li W J, Du X B, et al. Phylogenetic analysis and identification of biological characterization of Morganella morganii in Kangaroo [J]. China Animal Husbandry＆ Veterinary Medicine, 2010, 37(3):48—51 [趙耘, 李偉杰, 杜昕波, 等. 袋鼠摩根氏菌生物特性鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析. 中國畜牧獸醫(yī), 2010, 37(3): 48—51]

[11] Kong L, Zhu N Y, Bei Y J, et al. Isolation and identification of pathogenic Morganella morganii isolates from Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis [J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2013, 44(3): 722—727 [孔蕾, 朱凝瑜,貝亦江, 等. 中華鱉(Pelodiscus sinensis)摩氏摩根菌(Morganella morganii)的鑒定及致病性研究. 海洋與湖沼, 2013, 44(3): 722—727]

ISOLATION, IDENTIFICATION AND ANTIBIOTIC SENSITIVITY TEST OF MORGANELLA MORGANII FROM MAUREMYS MUTICA

LAN Yun, HU Xiu-Cai, Lü Ai-Jun, SHEN Xiao-Jing, ZHU Ai-Hua and FENG Zhao-Jun
(School of Life Sciences, Jiangsu Normal University, Xuzhou 221116, China)

黃喉擬水龜; 摩氏摩根菌; 分離鑒定; 致病性; 藥敏試驗

Mauremys mutica; Morganella morganii; Isoltation and identification; Pathogenicity; Antibiotic sensitivity test

S947.9

A

1000-3207(2014)06-1173-06

10.7541/2014.170

2013-09-22;

2014-03-02

國家自然科學基金(31272692、30800847); 江蘇省“青藍工程”(2014)資助

蘭云(1987—), 女, 江蘇連云港人; 碩士研究生; 主要從事微生物及免疫學研究。E-mail: lanyun9058@126.com

呂愛軍(1973—), E-mail: lajand@126.com