馬瑞麗，李倩倩，徐秀泉，李 梅，湯 建*，歐陽臻

(1.江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2.定西市旱農(nóng)科研推廣中心，甘肅 定西 743000)

虎刺(DamnacanthusindicusGaertn. f.)，又名繡花針，小黃連，分布于長江流域及以南地區(qū)，中醫(yī)上主要用于治療肝炎、風(fēng)濕痹痛、黃疸水腫等病癥[1-2]，同時也是瑤藥中具有代表性的藥材之一，用于治療用于肝炎、身體虛弱及小兒疳積等[3]。該植物化學(xué)成分報道較多的是以大黃素為代表的蒽醌類化合物[4-7]，關(guān)于該植物中的黃酮類化合物的報道主要以含量測定為主[8]。本文中采用清除DPPH自由基模型、還原力模型以及總抗氧化力模型評價虎刺提取物和各萃取部位的抗氧化能力、抑菌活性，以及與樣品中總黃酮含量的關(guān)系。以期對虎刺的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎刺藥材于2009年9月購于亳州藥材市場(產(chǎn)地 湖南)，經(jīng)本院歐陽臻教授鑒定為茜草科虎刺屬植物Damnacanthusindicus(Linn) Gaertn. f.。全草粉碎(10～20目) 后冷藏備用。

蘆丁對照品 中國藥品生物制品鑒定所；1, 1-苯基-2-苦肼基自由基(DPPH.) 美國Sigma公司；維生素C(分析純)、95%乙醇(分析純)、去離子水、雙純水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2102PCS型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司； ZF超聲波清洗機(jī) 上海致豐電子科技有限公司； LOOYE ZX98-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海魯伊工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

秤取虎刺藥材(10～20目)100 g，加入80%乙醇500 mL，于45℃下超聲提取20 min，抽濾后濾渣重復(fù)提取2次。提取液濃縮至無醇味(約120 mL)，取其中20 mL濃縮液蒸除溶劑，得到3.5 g浸膏。剩余部分分別用100 mL×3石油醚，二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，蒸除溶劑后得到3個萃取部位，分別為0.3 g，1.2 g和2.6 g。剩余水相經(jīng)HP20樹脂柱，水洗除去無機(jī)鹽、黏液、寡糖等，90%乙醇洗脫，90%部位蒸除溶劑后凍干，得2.1 g粉末。樣品密閉冷藏于-20℃冰箱中備用。

1.3.2 抗氧化活性的測定

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[9-10]方法， 1 mL不同濃度樣品溶液(0～200 μg/mL)，加1 mL 200 μM的DPPH乙醇溶液，加80%乙醇2 mL，共計(jì)反應(yīng)體系為4 mL，搖勻，在暗處放置30 min，在517 nm處測定吸光度A。同時測定1 mL DPPH與3 mL 80%乙醇混合液的吸光度A′。對照組為Vc。清除率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.2.2 還原力測定

參照文獻(xiàn)[9]方法，分別取各樣品待測液50，100，200，300，400 μL于具塞試管中，各自補(bǔ)充蒸餾水至1 mL，加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合后置于50℃水浴中20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，4 800 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵2.5 mL，混勻，靜置10 min，在700 nm處測定吸光度，用蒸餾水調(diào)零。對照組為Vc。

1.3.2.3 總抗氧化力測定

按文獻(xiàn)[10]采用磷鉬酸鹽法測定總抗氧化力，精密稱取磷酸鈉1.065 g，鉬酸銨0.494 g，濃硫酸3.28 mL，定容于100 mL，得混合液。取樣品500 μg/mL，加3 mL混合液，95 ℃水浴90 min，在695 nm處測吸光度。對照組為Vc。清除率按公式(2)計(jì)算：

(2)

1.3.3 抑菌活性測定

參照紙片擴(kuò)散法[11]，金黃色葡萄球菌(ATCC 12600，G+),綠膿桿菌(ATCC 10145，G-),大腸桿菌(ATCC 11775，G-)和克雷伯氏肺炎菌(ATCC 13883，G-)于4 ℃在熔融Mueller-Hinton營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)。10 μL樣品(20 mg/mL)滴加到紙片，新霉素(neomycin，500 μg/mL)為陽性對照藥，于37 ℃培養(yǎng)18 h后測定抑菌圈。

1.3.4 總黃酮的含量的測定

參照文獻(xiàn)[10]方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.012X-0.002 2，R2=0.999 7，線性范圍為8～40 μg/mL。

準(zhǔn)確稱量25 mg樣品，定容至25 mL容量瓶中。采用Al(NO)3-NaNO2比色法測定各提取部位及藥材80%乙醇提取浸膏的總黃酮含量，以蘆丁計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 虎刺各部位的抗氧化能力

2.1.1 各部位清除DPPH自由基活性

虎刺80%乙醇提取物(1)與石油醚部位(2)、二氯甲烷部位(3)、乙酸乙酯部位(4)及水溶性部位(5)清除DPPH自由基(DPPH·)能力有較大差異，結(jié)果詳見表1。

表1 虎刺提取物及各部位清除DPPH·活性及總黃酮含量

由表1可知，乙酸乙酯部位(4)清除DPPH自由基活性較強(qiáng)，IC50為187.3 μg/mL。二氯甲烷部位(3)和水部位(5)對DPPH自由基清除率較弱，石油醚部位(2)清除DPPH自由基活性較強(qiáng)最弱，IC50> 800 μg/mL。

2.1.2 虎刺各部位的還原力

研究證實(shí)還原力與物質(zhì)的抗氧化活性是密切相關(guān)的，還原力高的抗氧化劑可以提供電子使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的分子而失去活性，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中的中間氧化物。圖1表明，虎刺各部位中乙酸乙酯部位(4)還原力最強(qiáng)，各樣品的抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)橐宜嵋阴ゲ课?水溶性部位>二氯甲烷部位>80%乙醇提取物>石油醚部位，但各部位的還原力遠(yuǎn)弱于Vc。

Vc的濃度是0，25，50，100，200，300 μg/mL

2.1.3 虎刺各部位的總抗氧化力

采用磷鉬酸鹽法測定總抗氧化性，吸光度越大則說明其還原能力越強(qiáng)，抗氧化性也越強(qiáng)[10]。圖2表明，乙酸乙酯部位的還原能力最強(qiáng)，石油醚部位(2)和水溶性部位(5)的還原能力最弱，1 mg/mL濃度下吸光度A分別為0.3和0.4。各樣品的總抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)樗苄圆课?二氯甲烷部位>乙酸乙酯部位≈80%乙醇提取物>石油醚部位。

Vc的濃度是0，25，50，100，200，300 μg/mL

2.2 虎刺各部位抑菌實(shí)驗(yàn)

表2數(shù)據(jù)表明，虎刺二氯甲烷部位(3)、石油醚部位(2)和乙酸乙酯部位(4)具有一定的抑菌活性，其中二氯甲烷部位(3)對肺炎菌(ATCC 13883)的抑菌率最強(qiáng)，抑菌圈直徑為1.1 cm，水溶性部位(5)和80%乙醇提取物(1)的抑菌較弱。各樣品對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出一定程度的敏感性。最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二氯甲烷部位(3)和乙酸乙酯部位(4)最小抑菌濃度為1.0 mg/mL左右(其它樣品的最小抑菌濃度數(shù)據(jù)未列出)。

表2 虎刺80%乙醇提取物及各部位的抗菌活性

2.3 各部位的總黃酮含量

表1說明，虎刺80%乙醇提取物(1)與石油醚部位(2)、二氯甲烷部位(3)、乙酸乙酯部位(4)及水溶性部位(5)的總黃酮含量存在較大差異，其中二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位的總黃酮含量較高，分別為38.96 mg/g和35.04 mg/g，而水溶性部位和石油醚部位中總黃酮含量較低，僅為7.52 mg/g和3.29 mg。

乙酸乙酯部位和二氯甲烷部位含有豐富的總黃酮，表現(xiàn)出良好的除DPPH自由基能力和還原力，石油醚部位的總黃酮含量較低，3種抗氧化模型中均表現(xiàn)出微弱的抗氧化活性。但水溶性部位的黃酮含量雖然低，但在總抗氧化力和還原力模型中均表現(xiàn)良好的抗氧化活性，也具有一定的清除DPPH自由基能力。表明虎刺中的黃酮類化合物可能是其發(fā)揮抗氧化作用重要但非唯一的活性物質(zhì)，尤其是水溶性部位，可能含有非黃酮類的抗氧化物質(zhì)。結(jié)合表2，含總黃酮較多的二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位表現(xiàn)出一定的抑菌活性，而黃酮含量較低的石油醚部位也表現(xiàn)出一定程度的抑菌活性，可見總黃酮不是抗菌的主要活性物質(zhì)?；⒋痰囊志钚钥赡芘c蒽醌類化合物有關(guān)。

3 結(jié) 論

目前國內(nèi)外對虎刺的研究較少，化學(xué)成分研究主要涉及蒽醌類化合物。對于其藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究還不夠深入，關(guān)于該藥材中黃酮類化合物的研究也是以預(yù)實(shí)驗(yàn)和含量測定居多。本文中考察虎刺的80%乙醇提取物和四個部位在DPPH自由基、還原力和總抗氧化力模型中的抗氧化能力和抑菌活性，以及和總黃酮含量之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)虎刺總黃酮可能是其發(fā)揮抗氧化作用的活性物質(zhì)。鑒于黃酮類成分在抗氧化、在抗炎等方面的生物活性，因此，虎刺中黃酮類化合物可能是該藥材廣泛藥理活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。深入研究虎刺中包括黃酮在內(nèi)的化學(xué)成分及其藥理活性，對進(jìn)一步開發(fā)虎刺這種常用的民族藥具有重要意義。

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