吳建英，宋建新，曹金萍，涂智杰，余慧宏，胡芹，魏建萍，潘劍

(江西省景德鎮(zhèn)市疾病預(yù)防控制中心，江西 景德鎮(zhèn)333000)

食品中污染的病原菌是引起食源性疾病的主要因素之一。金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aures)、產(chǎn)單核李斯特菌(Listeriamonocytogens)和沙門菌(Salmonella spp)是肉與肉制品、乳與乳制品、水產(chǎn)品、冷凍飲料與飲料、調(diào)味品[1]等都需要檢測的3種食源性致病菌。目前對這些食源性致病菌的檢測，主要還是按照傳統(tǒng)的細菌學(xué)培養(yǎng)方法，一般需3~7d，操作繁瑣，耗時費力[1]。因此急需建立快速有效的檢測方法。

本研究通過使用LB培養(yǎng)液進行8h振蕩培養(yǎng)增菌與優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系，建立一種低廉、高效、簡便的多重PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 .1菌株 實驗所用菌株共7株，分別為金黃色葡萄球菌 (ATCC29213)、產(chǎn)單核李斯特菌(CMCC54004)、沙門菌(H9812)、志賀菌(ATCC10412)、蠟樣芽孢桿菌 (CMCC(B)63303)、大腸埃希菌O157(ATCC43888)、阪崎腸桿菌(ATCC29544)。所有菌株均為本實驗室保藏菌株。

1.1 .2培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)液組成成份胰蛋白胨10g/L、 酵母提取物 5g/L、NaCl 10g/L， 使用 1mol/L NaOH調(diào)pH至7.0。

1.1 .3 試劑及儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、10×PCR buffer、PCR 回 收 試 劑 盒 、DL2000 DNA Marker購于北京天根生化科技有限公司；瓊脂糖為西班牙Biowest公司產(chǎn)品；溴化乙錠(EB)為美國Sigma公司產(chǎn)品；引物由上海生工合成。PTC-200 PCR儀為美國MJ公司產(chǎn)品；DYY-6C電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)；GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；LEGEND MICRO 21Centrifuge高速離心機為美國Thermo Scientific公司生產(chǎn)；FLY-211B恒溫搖床。

1.2 方法

1.21 引物設(shè)計 根據(jù)金黃色葡萄球菌編碼耐熱核酸酶基因nuc[2]、產(chǎn)單核李斯特菌特異溶血素基因hlyA[3]、沙門菌編碼侵染上皮細胞表面蛋白的invA基因[4]設(shè)計了3對引物)(表1)。以3種標準菌株DNA為模板 ，PCR擴增后使用PCR回收試劑盒回收擴增片段送至捷瑞公司進行測序驗證。

表1 金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核李斯特菌、沙門菌多重PCR反應(yīng)引物序列

1.2 .2 DNA模板的制備 將7株保藏菌株按照不同組合方式接種于5ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)。取菌液100μl置于離心管中，12000r/min離心10min后，棄上清，收集菌體，加1ml 1×TE洗滌1次，然后以50μl 0.5mol/L NaOH懸浮菌體，沸水浴加熱5min，迅速冷卻后加入50μl 1mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液，充分混勻，12000r/min離心5min，上清即為DNA 模板[5]。

1.2 .3引物特異性實驗 以表1的3對引物分別對7株實驗菌株的DNA進行PCR擴增以驗證引物的特異性。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 30s，進行 35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)體系(20μl):10×PCR buffer 2μl,Mg2+濃度 2.0mmol/L，2.5 mmol/L dNTPs 2.0μl，10 mmol/L 引 物 0.5μl，DNA模板 1μl，5U/μl Taq DNA 聚合酶 0.3μl，加 ddH2O補足20μl。PCR產(chǎn)物檢測：取5μl PCR產(chǎn)物加溴酚藍混勻，以DL2000 Marker作參照，在1.5%瓊脂糖凝膠(含 EB 0.5μg/ml)中，100V 電泳，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2 .4多重PCR引物濃度的優(yōu)化

1.2 .4.1 invA引物濃度的優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系，除了混合DNA模板(金黃色葡萄球菌ATCC29213、沙門菌 H9812、產(chǎn)單核李斯特菌 CMCC54004)1μl，以及 invA 引物濃度 (nmol/L) 分別為 10、20、40、80、160、320和640外，其他物質(zhì)的含量和PCR的反應(yīng)條件不變。

1.2 .4.2 hlyA引物濃度的優(yōu)化 以獲得的最佳濃度的 invA 引物與濃度(nmol/L)10、20、40、80、160、320和640的hlyA引物進行雙重PCR，確定hlyA引物的最佳濃度。

1.2 .4.3 nuc引物濃度的優(yōu)化 用最佳濃度invA和hlyA 引物與濃度(nmol/L)10、20、40、80、160、320 和640的nuc引物進行三重PCR，確定nuc引物的最佳濃度。

1.2 .5多重PCR檢測LB培養(yǎng)液中的病原菌 將金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核李斯特菌和沙門菌的純培養(yǎng)物分別、同時或與其他菌(包括志賀菌、大腸埃希菌O157、蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌)接種于LB培養(yǎng)液中，混勻。所有菌的接種量均為平均5cfu/ml。采用建立的PCR方法進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性 采用表1的3對引物對7株實驗菌株進行PCR擴增，以分析引物的特異性，結(jié)果顯示，3對引物擴增目的產(chǎn)物測序后與預(yù)期結(jié)果一致，而且本實驗所設(shè)計的引物特異性良好。

表2 引物特異性實驗結(jié)果

2.2 多重PCR引物濃度的確定 按照沙門菌、產(chǎn)單核李斯特菌和金黃色葡萄球菌的順序?qū)z測基因進行多重PCR的引物濃度進行優(yōu)化[5]。

2.2.1 invA引物濃度的優(yōu)化 以金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核李斯特菌和沙門菌的混合DNA為模板，分別對濃度(nmol/L)為 10、20、40、80、160、320 和 640的invA引物進行PCR，結(jié)果如圖1。當invA引物濃度為40nmol/L(泳道3)時，針對invA基因的擴增條帶清晰且無拖尾。因此，本研究采用40 nmol/L的invA引物進行以下實驗。

圖1 invA引物濃度的優(yōu)化

2.2 .2 hlyA引物濃度的優(yōu)化 以金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核李斯特菌和沙門菌的混合DNA為模板，采用40nmol/L的invA引物分別與濃度 (nmol/L)為10、20、40、80、160、320 和 640 的 hlyA 引物組合進行雙重PCR，結(jié)果如圖2。當invA引物濃度為40nmol/L，hlyA 引物濃度為 40nmol/L(泳道 3)和80nmol/L(泳道4)時，能成功地擴增出針對invA和hlyA基因的兩條帶，且條帶清晰，效果好。因此，本研究采用2個組合用于以下實驗。

圖2 hlyA引物濃度的優(yōu)化

2.2 .3 nuc引物濃度的優(yōu)化 以金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核李斯特菌和沙門菌的混合DNA為模板，采用invA引物濃度為40nmol/L和hlyA引物濃度分別為40nmol/L和80nmol/L 2個組合，分別與濃度(nmol/L)為 10、20、40、80、160、320 和 640 的 nuc 引物進行三重PCR，由圖3可以看出，當invA、hlyA和nuc的引物濃度(nmol/L)分別為40、40和160(泳道 5)，以及它們的濃度(nmol/L)為 40、80 和 160(泳道12)時，均能擴增出針對上述3個基因清晰的條帶。綜合上述實驗結(jié)果，本研究將以invA、hlyA和nuc的引物濃度分別為 40nmol/L、80nmol/L和160nmol/L的濃度組合進行以下多重PCR實驗。

2.3 LB培養(yǎng)液中待測菌多重PCR檢測 將金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核李斯特菌、沙門菌、干擾菌(志賀菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌O157和阪崎腸桿菌)分別或同時接種到LB培養(yǎng)液中37℃振蕩培養(yǎng)8h進行增菌[6]。實驗重復(fù)3次，提取DNA進行多重PCR檢測，結(jié)果如圖4。從圖4可以看出，接種5cfu/ml金黃色葡萄球菌和其他干擾菌僅擴增出132bp的特異性條帶；接種5cfu/ml沙門菌和其他干擾菌僅擴增出480bp的特異性條帶；接種5cfu/ml產(chǎn)單核李斯特菌和其他干擾菌僅擴增出217bp的特異性條帶。同時接種平均5cfu/ml金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核李斯特菌、沙門菌和其他干擾菌后，在泳道上只有3條特異性條帶，而沒有其他條帶，表明多重PCR的特異性好。

注：1~7：invA 和 hlyA 均為 40nmol/L，nuc的引物濃度（nmol/L）分別為 10、20、40、80、160、320 和 640；8~14：invA 和 hlyA 的引物濃度分別為40nmol/L和80nmol/L，nuc引物濃（nmol/L）分別為 10、20、40、80、160、320 和 640；M：DL2000 Marker

圖4 接種LB培養(yǎng)液的待測菌多重PCR結(jié)果

3 討論

本研究通過對多重PCR條件的優(yōu)化，建立了一種能同時檢測金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核李斯特菌和沙門菌多重PCR方法。通過文獻檢索及生物信息學(xué)方法選取了金黃色葡萄球菌nuc、產(chǎn)單核李斯特菌hlyA和沙門菌invA的特有基因進行引物設(shè)計。為了能夠更好的檢測本實驗所設(shè)計的引物的特異性，實驗中引入志賀菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌O157、阪崎腸桿菌為干擾菌進行PCR擴增，結(jié)果顯示，設(shè)計的引物具有很好的特異性；通過對擴增產(chǎn)物的回收測序，證明本實驗室設(shè)計的擴增引物能夠達到預(yù)期結(jié)果。

本實驗引物擴增的產(chǎn)物大小分別為nuc127bp、hlyA 217bp,invA480bp，由于產(chǎn)物越大所消耗的PCR反應(yīng)管內(nèi)的dNTP消耗就越多，一旦dNTP消耗完畢PCR反應(yīng)立即停止，因此本實驗從大產(chǎn)物的引物濃度開始優(yōu)化。研究結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物越大的引物使用濃度越小，可以減少其大量消耗dNTP；而擴增產(chǎn)物較小的引物由于擴增效率高，如果其引物濃度過大，擴增產(chǎn)物大的引物甚至擴增不出產(chǎn)物。因此最終確定以金黃色葡萄球菌nuc基因、產(chǎn)單核李斯特菌hlyA基因和沙門菌invA基因設(shè)計引物，濃度分別為160、80和40nmol/L為實驗的最佳濃度。

為了驗證此種方法檢測的靈敏度，本實驗室使用LB培養(yǎng)液對金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核李斯特菌、沙門菌、志賀菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌O157和阪崎腸桿菌7種菌采用不同組合方式進行振蕩培養(yǎng)增菌，增菌時間為8h。增菌后采用堿煮沸法提取DNA，以金黃色葡萄球菌nuc基因、產(chǎn)單核李斯特菌hlyA基因和沙門菌invA基因設(shè)計的特異引物，濃度分別為160、80和40nmol/L時，對其進行擴增，結(jié)果顯示本實驗的檢出限為5cfu/ml，而有些相關(guān)文獻顯示能夠達到1cfu/ml的檢出限，可能是因為其提取方法的不同引起的，但此法具有簡單，不需要特殊耗材，整個檢測過程少于12h等優(yōu)點[7]。而傳統(tǒng)細菌學(xué)方法需要使用不同的增菌液對可疑物進行一次增菌，二次增菌，分離培養(yǎng)，生化反應(yīng)等一系列繁雜操作才能得出結(jié)果。因此多重PCR檢測具有簡便、快速、經(jīng)濟，具有較好的應(yīng)用前景。

本研究采用堿煮沸法提取DNA模板，解決了革蘭陽性菌在沸水中破壁效果差的問題。由于堿煮沸法對試劑要求簡單，并且提取步驟少，很適合基層醫(yī)療單位處理食物中毒病原微生物的定性檢測。同時采用LB培養(yǎng)液對金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核李斯特菌和沙門菌進行增菌并獲得較好的增菌效果。也有人報道稱直接從樣本中富集菌體進行PCR，這樣檢測結(jié)果假陽性的風(fēng)險加大，同時不能區(qū)分死菌與活菌，而增菌后檢測可以解決上述問題。

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