萬(wàn)華 ，劉川 ，鄒葉青 ，石慶芝

(1、南昌市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330008；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，血液科，江西 南昌330006)

人巨細(xì)胞病毒 (HCMV)在人群中的感染率很高，發(fā)達(dá)國(guó)家約為 60%，在發(fā)展中國(guó)家，或者某些特殊人群中，感染率超過(guò) 95%[1]。HCMV感染是造血干細(xì)胞移植受者早期的主要感染并發(fā)癥及死亡原因,既往因HCMV導(dǎo)致的間質(zhì)性肺炎病死率高達(dá)80%以上。研究資料表明,在HCMV病發(fā)生之前,及時(shí)使用抗病毒藥物治療,可以有效控制病毒感染，預(yù)防和減少HCMV病的發(fā)生,降低移植受者的死亡率[2]。因此，HCMV動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)對(duì)HCMV病的早期診斷及抗病毒治療，降低移植受者的死亡率極為重要。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)方法對(duì)40例造血干細(xì)胞移植術(shù)后患者外周血漿HCMV-DNA進(jìn)行動(dòng)態(tài)定量監(jiān)測(cè)，探討定量PCR法對(duì)HCMV活動(dòng)性感染的診斷價(jià)值及對(duì)臨床用藥的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2012年1月至2012年12月，南昌大學(xué)二附院血液科收治的造血干細(xì)胞移植患者40例,其中急性髓系白血病8例、急性淋巴細(xì)胞白血病10例、慢性髓系白血病15例、骨髓增生異常綜合癥7例。所有患者常規(guī)進(jìn)行移植后巨細(xì)胞病毒監(jiān)測(cè),直至停用全部免疫抑制劑。對(duì)照組60名來(lái)自健康體檢人群,各項(xiàng)體檢指標(biāo)均無(wú)明顯異常。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2 .1 DNA提取 無(wú)菌操作采集患者EDTA抗凝靜脈血5 ml，使用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，然后直接加50μl DNA提取液充分混勻，沸水浴10min,12000r/min離心5 min，取上清液直接用于PCR或-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 .2 HCMV-DNA定量 使用中山大學(xué)達(dá)安基因有限責(zé)任公司提供的HCMV熒光定量試劑盒，選取HCMV保守的序列g(shù)H 1202-1407，引物1TGGACCTGGCCAAACGAGCCC 1202-1222，引物2TGGACGAGGCTGCCCATGAGG 1427-1407。在ABI-7500擴(kuò)增儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，其擴(kuò)增條件為:93℃預(yù)變性 2 min,，93℃變性 45 s，55℃退火 60s，10 個(gè)循環(huán)；93℃變性 30 s，55℃退火 45s，30個(gè)循環(huán)。試劑盒提供的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品 (104~107拷貝/ml)以及陰性對(duì)照同時(shí)擴(kuò)增，得出所測(cè)樣本中的核酸載量值，用基因拷貝/ml表示。每次試驗(yàn)中，陰性對(duì)照的Ct值(循環(huán)閾值)不顯示任何數(shù)值，檢測(cè)下限為 5.0×102拷貝/ml。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料的組間均值比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 real-time PCR共檢測(cè)40例造血干細(xì)胞移植患者416份血標(biāo)本，其中12例共96份標(biāo)本陽(yáng)性，陽(yáng)性率23.1%(96/416),HCMV 載量介于 5.0×102~1.0×107拷貝/ml之間。對(duì)照組陽(yáng)性率3.3%(2/60),HCMV載量介于5.0×102~1.0×103拷貝/ml之間。移植組與對(duì)照組間陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

表1 移植組和對(duì)照組476份血液標(biāo)本HCMV-DNA檢測(cè)結(jié)果

3 討論

HCMV屬于皰疹病毒科,是一種特異性的DNA病毒，為已知人類皰疹病毒中最大的一組病毒[3]。HCMV在普通人群中的感染率很高,大多數(shù)感染呈臨床不顯性感染或潛伏感染[4]。造血干細(xì)胞移植術(shù)后應(yīng)用免疫抑制劑使機(jī)體抵抗力下降，潛伏病毒重新激活，引起HCMV活動(dòng)性感染，包括HCMV間質(zhì)性肺炎、肝炎、胃腸炎等。Ruiz等報(bào)道，在移植后的第1年里有超過(guò)一半的患者會(huì)有HCMV原發(fā)感染或再激活的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)[5]。所以，建立敏感的HCMV檢測(cè)方法，及時(shí)應(yīng)用抗病毒治療，對(duì)于預(yù)防和減少HCMV病的發(fā)生、降低移植受者的死亡率具有重要意義[6]。

Real-time PCR方法具有敏感性高，快速、定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)。本研究通過(guò)real-time PCR方法檢測(cè)造血干細(xì)胞植患者血漿HCMV-DNA，有助于早期、準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)HCMV感染，進(jìn)而對(duì)早期HCMV感染的患者進(jìn)行干預(yù)性治療，使HCMV載量降低并最終轉(zhuǎn)陰，從而降低移植后HCMV病的致死率，提高造血干細(xì)胞植患者的長(zhǎng)期生存率，具有重要的臨床意義。

[1]Griffiths PD,Emery VC,Milne RC.Cytomegalovirus.In:Douglas D,Richmand,Whitley RJ.Clinical Virology[M].3rd ed.ASM Press,2009:475-506.

[2]趙曉甦,劉代紅,許蘭平,等.異基因造血干細(xì)胞移植后巨細(xì)胞病毒肺炎臨床特點(diǎn)分析[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,41(5):548-553.

[3]Munoz-Cobo B,Solano C,Costa E,et al.Dynamics of cytomegalovirus(CMV)plasma DNAemia in initial and recurrent episodes of active CMV infection in the allogeneic stem cell transplantation setting:implications for designing preemptive antiviral therapy strategies[J].Biol Blood Marrow Transplant,2011,17(11):1602-1611.

[4]萬(wàn)華,都莉.免疫低下狀態(tài)群體感染人巨細(xì)胞病毒的研究進(jìn)展[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(6):573-575.

[5]Ruiz-Camps I,Len O,de la Camara R,et al.Valganciclovir as preemptive therapy for cytomegalovirus infection in allogeneic haematopoietic stem cell transplant recipients[J].Antivir Ther,2011,16(7):951-957.

[6]Prevention and management of CMV-related problems after hematopoietic stem cell transplantation.[J].Bone Marrow Transplant,2002,29(8):633-638.