王長奇，楊志華，羅娜，陳燕萍，周開良

(江西萍礦總醫(yī)院檢驗科，江西 萍鄉(xiāng)337000)

人乳頭瘤病毒 (human papillomavious，HPV)為小的雙鏈DNA病毒，其中高危型HPV是生殖道惡性腫瘤的危險因素，與宮頸癌的發(fā)生有著密切關系[1]，尤以HPVl6型感染率最高，約50%的宮頸癌患者腫瘤組織的DNA為HPVl6型[2，3]，而 HPV早期基因E6 E7的表達在細胞癌變過程和維持細胞惡性表型方面起著重要作用。為了分析研究江西地區(qū)HPVl6感染的基本情況，我們從宮頸組織中分離、克隆了HPVl6 E7基因，進行序列測定，并與網上發(fā)表的毒株比較，發(fā)現(xiàn)江西地方株與標準株(德國)及其他地區(qū)分離株之間存在一些變異。該株的獲得，將豐富我國HPVl6感染的流行病學資料，為HPV疫苗的開發(fā)應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 采用住院病人，共14人；年齡在32~78歲之間；平均年齡55歲。所有病例來自贛州6例，鷹譚1例，南昌市內3例，九江2例，萍鄉(xiāng)2例。病理學診斷：鱗癌6例，CINⅢ 6例，CINⅡ 2例，臨床病理資料于病理科獲得。同時采用5例宮頸脫落細胞學檢查 形態(tài)無異常、HPV檢測陰性標本為對照。

1.2 試劑及儀器 Taq聚合酶、限制性內切酶、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)等購自上海生物工程公司，T4DNA連接系統(tǒng)、DNA Marker購自大連寶生物公司，凝膠回收試劑盒購自QIAgen公司。質粒和宿主菌pGEM-Teasy載體購自Promega公司，宿主菌DH5a由比較醫(yī)學中心保存。DNA提取試劑盒，人乳頭瘤病毒核酸擴增分型檢測試劑盒及核酸分子雜交儀由潮州凱普生物化學有限公司提供，PCR儀采用ABI公司9700型號。

1.3 標本采集及處理 暴露宮頸,用棉拭子擦去宮頸口多余分泌物,用取樣刷置于宮頸口順時針方向旋轉5～6周以獲取足量的宮頸脫落上皮細胞。將取樣后的宮頸刷放入含有細胞脫洗保存液的加蓋微量離心管(1.5ml)中,-22℃冷凍保存，保存時間不超過3個月。標本處理時充分洗脫宮頸刷上樣本,留取含脫落宮頸細胞的洗脫液。

1.4 HPV 16亞型的鑒定 按試劑盒說明書進行HPV DNA提取，PCR擴增，核酸分子快速導流雜交，結果判讀，按芯片上HPV亞型分布的相應著色點判讀，統(tǒng)計出含有16亞型的樣本。

1.5 HPV16 E7基因擴增

1.5 .1 E7特異性引物的設計 根據已發(fā)表的HPVl6標準株DNA全序列設計，跨HPVl6 E7整個閱讀框(562~858)，并包含起始密碼子ATG和終止密碼子 TAA。 HPVl6 E7特異引物序列(5’-3’)：上游引物：GAATTCAGAACAGCAATACAACAAACC下游引物：CAAGCTTGCAGCCTCTACATAAAACCATC在上下游引物5’端分別設計了EcoRⅠ和HandlⅡ酶切位點。

1.5 .2 E7基因的擴增 用E7特異性引物PCR擴增含有16亞型的樣本DNA,反應參數(shù)：95℃9min預變性,95℃ 20s,55℃ 30s,72℃,30s,40個循環(huán)，72℃，延伸5min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 HPVl6 E7基因的克隆 將PCR擴增的DNA片段經1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠回收試劑盒回收，與pGEM-Teasy載體按常規(guī)方法連接、轉化宿主菌DH5a，通過藍白斑和EcoRI、HandlII雙酶切篩選陽性克隆。

1.7 HPVl6 E7基因的序列測定 HPVl6 E7基因的序列測定由上海生物工程公司完成。運用DNAMAN軟件對測序的E7基因序列進行分析。

2 結果

2.1 HPVl6 E7基因PCR結果 以宮頸癌組織提取的DNA為模板，PCR法擴增目的片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳后，在約600 bp處可見一清晰條帶，與預計片斷大小一致。

2．2 HPVl6 E7基因的序列分析 運用DNAStar軟件，將獲得的地方株HPVl6 E7核苷酸序列與網上公布的德國標準株[4]、E7基因序列進行比較，結果顯示地方株在核苷酸水平上與德國標準株有99．7%的同源性。

2.3 測序比對 HPV16 E7變異核苷酸水平上一些位點的變異引起了三聯(lián)密碼子的改變，進而引起氨基酸的變化，另一位點突變雖然改變了三聯(lián)密碼子，并未導致氨基酸水平上的變化。見表1。2.4在HPV16 E7基因核苷酸及氨基酸序列變異中鱗癌有6例 (A647G 4例、A646C 1例、C790T 1例),CINⅢ 6例(A647G 2例、A646C 1例、C790T 1例、T760C 1 例、T843C1 例)，CINⅡ 2 例(A647G1例、T846C1例)。在鱗癌和CINⅢ中12例都有氨基酸錯義突變， 以 A647G、A646C、C790T多見，5例陰性對照均未見異常。

表1 E7基因核苷酸及氨基酸序列變異表

3 討論

大量研究表明，高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生的重要原因，特別是HPVl6，約占HPV陽性宮頸癌的50%，HPV早期基因E6、E7的過量表達是誘發(fā)宮頸癌的關鍵所在。E7的C端60個氨基酸中存在 2個“Cys—X—X—Cys”鋅指結構，N 端 37個氨基酸與腺病毒E1A和SV40T抗原相似，能與pRb結合使之失去抑癌活性，導致細胞癌變，在腫瘤組織中HPV DNA常整合于細胞基因組不穩(wěn)定區(qū)和轉錄活躍區(qū)，影響這些區(qū)域的功能，如HPV DNA整合在13q14，恰好是抑癌基因Rb所在位點[5]。

世界不同國家和地區(qū)的學者在對本地區(qū)HPVl6E7基因進行克隆和序列分析過程中發(fā)現(xiàn),HPVl6 E7基因較為保守，但各地HPVl6 E7基因之間仍存在一些變異。我國伍欣星報道了湖北地區(qū)宮頸癌組織中HPVl6 E7變異株[6]有兩處堿基發(fā)生了C→T突變，氨基酸序列N端是完整的，c端則由于基因的突變，使所編碼的蛋白多肽提前終止；熊金虎報道的湖北不同地區(qū)宮頸癌組織中HPVl6 E7變異株[7]，顯示武漢地區(qū)變異株只有一處堿基突變，氨基酸序列未發(fā)生改變，湖北高發(fā)區(qū)(武峰縣)變異株有三處堿基突變，氨基酸序列發(fā)生了改變，但湖北地區(qū)仍以野生型為主；許雪梅報道[8]的山東地區(qū)HPVl6 E6、E7變異株中未發(fā)現(xiàn)E7基因突變；馬正海報道的新疆維吾爾族婦女宮頸癌組織中HPVl6 E7堿基序列和氨基酸序列與德國標準株均完全一致[9]。從我們研究來看，HPV16 E7堿基序列和氨基酸序列尤以A647G多見，占50%,錯義突變有3處，同義突變有3處,與上述作者報告基本相似。

通過對HPVl6 E7基因序列分析、比較，可以發(fā)現(xiàn)HPVl6 E7基因相對保守，但各國各地區(qū)流行株之間仍存在差異，本地區(qū)HPVl6 E7流行株，有6個堿基突變，鱗癌有6例(4例A647G、1例A646C、1例 C790T),CINⅢ6例 (2例 A647G、1例 A646C、1例 C790T、1例 T760C、1例 T843C)CINⅡ 2例(1例 A647G、1例 T846C)，6例鱗癌和 6例 CINⅢ都有氨基酸錯意突變，尤以A647G多見。本文氨基酸序列只有2例與標準株序列完全一致。提示HPVl6 E7基因片段內氨基端變異相對頻繁；而A646C C790T突變尚未見大量報道。

HPVl6 E7在核苷酸水平上均存在變異，與國外文獻報道一致[10]。而與國內相關文獻報道的HPVl6 E7“未發(fā)現(xiàn)變異”結論不同。這可能與樣本的大小、樣本的代表性、病人選擇標準、實驗設計、檢測方法等因素存在差異有關，此外，亦不能除外與這一地區(qū)E7基因序列存在多態(tài)性有關。地區(qū)HPVl6 E7還存在尚未見報道的突變位點，提示這一地區(qū)HPVl6變異具有多樣性；變異可能會增強其致癌性，提示為致癌預警信息；建議加強PVl6型E7內變異株檢查，做好宮頸癌患者致癌預警工作，將為我國HPV基因變異與宮頸癌的關系提供更完善的理論依據。

[1]Das BC，Sharma JK，Gopalkrishna V，et a1．A Frequency of human papillomavirus DNA sequences incervical carcinomas of Indian women as revealed by southern blot hybridization and polymerase chain reaction[J]．JMed Virol 1992,36(4)：239．

[2]張志勇,施橋發(fā).人乳頭瘤病毒與宮頸癌關系的研究進展[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2012,30(3):252-256.

[3]王長奇,王康,陳燕萍,等.HPV多重感染與宮頸病變關系的分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2012,30(2):166-168.

[4]左亞剛,王家璧,許雪梅,等.北京地區(qū)人乳頭瘤病毒 HPVFfiE7基因變異和序列分析[J].中華皮膚科雜志,2003;36:650．

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[7]熊金虎,伍欣星,譚云.不同地區(qū)HPVl6E7基因的克隆及序列差異分析[J]．中國病毒學,2002,17:211.

[8]許雪梅,司靜懿,劉世德,等.PRIVATE中國山東地區(qū)婦女宮頸癌組織中人乳頭瘤病毒16E6E7基因的分離、克隆和序列分析．中國醫(yī)學科學院學報1999;21:185.

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[10]Paul KSC,ChingWL,Tak HC,et al.Human papillomavirus type 16 Variant infection and risk for cervical neoplasia in southern China[J]．Infet Dis,2002,186(5):696-700．