王長奇，楊志華，羅娜，陳燕萍，周開良

(江西萍礦總醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 萍鄉(xiāng)337000)

人乳頭瘤病毒 (human papillomavious，HPV)為小的雙鏈DNA病毒，其中高危型HPV是生殖道惡性腫瘤的危險(xiǎn)因素，與宮頸癌的發(fā)生有著密切關(guān)系[1]，尤以HPVl6型感染率最高，約50%的宮頸癌患者腫瘤組織的DNA為HPVl6型[2，3]，而 HPV早期基因E6 E7的表達(dá)在細(xì)胞癌變過程和維持細(xì)胞惡性表型方面起著重要作用。為了分析研究江西地區(qū)HPVl6感染的基本情況，我們從宮頸組織中分離、克隆了HPVl6 E7基因，進(jìn)行序列測定，并與網(wǎng)上發(fā)表的毒株比較，發(fā)現(xiàn)江西地方株與標(biāo)準(zhǔn)株(德國)及其他地區(qū)分離株之間存在一些變異。該株的獲得，將豐富我國HPVl6感染的流行病學(xué)資料，為HPV疫苗的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 采用住院病人，共14人；年齡在32~78歲之間；平均年齡55歲。所有病例來自贛州6例，鷹譚1例，南昌市內(nèi)3例，九江2例，萍鄉(xiāng)2例。病理學(xué)診斷：鱗癌6例，CINⅢ 6例，CINⅡ 2例，臨床病理資料于病理科獲得。同時(shí)采用5例宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查 形態(tài)無異常、HPV檢測陰性標(biāo)本為對照。

1.2 試劑及儀器 Taq聚合酶、限制性內(nèi)切酶、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)等購自上海生物工程公司，T4DNA連接系統(tǒng)、DNA Marker購自大連寶生物公司，凝膠回收試劑盒購自QIAgen公司。質(zhì)粒和宿主菌pGEM-Teasy載體購自Promega公司，宿主菌DH5a由比較醫(yī)學(xué)中心保存。DNA提取試劑盒，人乳頭瘤病毒核酸擴(kuò)增分型檢測試劑盒及核酸分子雜交儀由潮州凱普生物化學(xué)有限公司提供，PCR儀采用ABI公司9700型號。

1.3 標(biāo)本采集及處理 暴露宮頸,用棉拭子擦去宮頸口多余分泌物,用取樣刷置于宮頸口順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)5～6周以獲取足量的宮頸脫落上皮細(xì)胞。將取樣后的宮頸刷放入含有細(xì)胞脫洗保存液的加蓋微量離心管(1.5ml)中,-22℃冷凍保存，保存時(shí)間不超過3個(gè)月。標(biāo)本處理時(shí)充分洗脫宮頸刷上樣本,留取含脫落宮頸細(xì)胞的洗脫液。

1.4 HPV 16亞型的鑒定 按試劑盒說明書進(jìn)行HPV DNA提取，PCR擴(kuò)增，核酸分子快速導(dǎo)流雜交，結(jié)果判讀，按芯片上HPV亞型分布的相應(yīng)著色點(diǎn)判讀，統(tǒng)計(jì)出含有16亞型的樣本。

1.5 HPV16 E7基因擴(kuò)增

1.5 .1 E7特異性引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)已發(fā)表的HPVl6標(biāo)準(zhǔn)株DNA全序列設(shè)計(jì)，跨HPVl6 E7整個(gè)閱讀框(562~858)，并包含起始密碼子ATG和終止密碼子 TAA。 HPVl6 E7特異引物序列(5’-3’)：上游引物：GAATTCAGAACAGCAATACAACAAACC下游引物：CAAGCTTGCAGCCTCTACATAAAACCATC在上下游引物5’端分別設(shè)計(jì)了EcoRⅠ和HandlⅡ酶切位點(diǎn)。

1.5 .2 E7基因的擴(kuò)增 用E7特異性引物PCR擴(kuò)增含有16亞型的樣本DNA,反應(yīng)參數(shù)：95℃9min預(yù)變性,95℃ 20s,55℃ 30s,72℃,30s,40個(gè)循環(huán)，72℃，延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 HPVl6 E7基因的克隆 將PCR擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠回收試劑盒回收，與pGEM-Teasy載體按常規(guī)方法連接、轉(zhuǎn)化宿主菌DH5a，通過藍(lán)白斑和EcoRI、HandlII雙酶切篩選陽性克隆。

1.7 HPVl6 E7基因的序列測定 HPVl6 E7基因的序列測定由上海生物工程公司完成。運(yùn)用DNAMAN軟件對測序的E7基因序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 HPVl6 E7基因PCR結(jié)果 以宮頸癌組織提取的DNA為模板，PCR法擴(kuò)增目的片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在約600 bp處可見一清晰條帶，與預(yù)計(jì)片斷大小一致。

2．2 HPVl6 E7基因的序列分析 運(yùn)用DNAStar軟件，將獲得的地方株HPVl6 E7核苷酸序列與網(wǎng)上公布的德國標(biāo)準(zhǔn)株[4]、E7基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示地方株在核苷酸水平上與德國標(biāo)準(zhǔn)株有99．7%的同源性。

2.3 測序比對 HPV16 E7變異核苷酸水平上一些位點(diǎn)的變異引起了三聯(lián)密碼子的改變，進(jìn)而引起氨基酸的變化，另一位點(diǎn)突變雖然改變了三聯(lián)密碼子，并未導(dǎo)致氨基酸水平上的變化。見表1。2.4在HPV16 E7基因核苷酸及氨基酸序列變異中鱗癌有6例 (A647G 4例、A646C 1例、C790T 1例),CINⅢ 6例(A647G 2例、A646C 1例、C790T 1例、T760C 1 例、T843C1 例)，CINⅡ 2 例(A647G1例、T846C1例)。在鱗癌和CINⅢ中12例都有氨基酸錯義突變， 以 A647G、A646C、C790T多見，5例陰性對照均未見異常。

表1 E7基因核苷酸及氨基酸序列變異表

3 討論

大量研究表明，高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生的重要原因，特別是HPVl6，約占HPV陽性宮頸癌的50%，HPV早期基因E6、E7的過量表達(dá)是誘發(fā)宮頸癌的關(guān)鍵所在。E7的C端60個(gè)氨基酸中存在 2個(gè)“Cys—X—X—Cys”鋅指結(jié)構(gòu)，N 端 37個(gè)氨基酸與腺病毒E1A和SV40T抗原相似，能與pRb結(jié)合使之失去抑癌活性，導(dǎo)致細(xì)胞癌變，在腫瘤組織中HPV DNA常整合于細(xì)胞基因組不穩(wěn)定區(qū)和轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，影響這些區(qū)域的功能，如HPV DNA整合在13q14，恰好是抑癌基因Rb所在位點(diǎn)[5]。

世界不同國家和地區(qū)的學(xué)者在對本地區(qū)HPVl6E7基因進(jìn)行克隆和序列分析過程中發(fā)現(xiàn),HPVl6 E7基因較為保守，但各地HPVl6 E7基因之間仍存在一些變異。我國伍欣星報(bào)道了湖北地區(qū)宮頸癌組織中HPVl6 E7變異株[6]有兩處堿基發(fā)生了C→T突變，氨基酸序列N端是完整的，c端則由于基因的突變，使所編碼的蛋白多肽提前終止；熊金虎報(bào)道的湖北不同地區(qū)宮頸癌組織中HPVl6 E7變異株[7]，顯示武漢地區(qū)變異株只有一處堿基突變，氨基酸序列未發(fā)生改變，湖北高發(fā)區(qū)(武峰縣)變異株有三處堿基突變，氨基酸序列發(fā)生了改變，但湖北地區(qū)仍以野生型為主；許雪梅報(bào)道[8]的山東地區(qū)HPVl6 E6、E7變異株中未發(fā)現(xiàn)E7基因突變；馬正海報(bào)道的新疆維吾爾族婦女宮頸癌組織中HPVl6 E7堿基序列和氨基酸序列與德國標(biāo)準(zhǔn)株均完全一致[9]。從我們研究來看，HPV16 E7堿基序列和氨基酸序列尤以A647G多見，占50%,錯義突變有3處，同義突變有3處,與上述作者報(bào)告基本相似。

通過對HPVl6 E7基因序列分析、比較，可以發(fā)現(xiàn)HPVl6 E7基因相對保守，但各國各地區(qū)流行株之間仍存在差異，本地區(qū)HPVl6 E7流行株，有6個(gè)堿基突變，鱗癌有6例(4例A647G、1例A646C、1例 C790T),CINⅢ6例 (2例 A647G、1例 A646C、1例 C790T、1例 T760C、1例 T843C)CINⅡ 2例(1例 A647G、1例 T846C)，6例鱗癌和 6例 CINⅢ都有氨基酸錯意突變，尤以A647G多見。本文氨基酸序列只有2例與標(biāo)準(zhǔn)株序列完全一致。提示HPVl6 E7基因片段內(nèi)氨基端變異相對頻繁；而A646C C790T突變尚未見大量報(bào)道。

HPVl6 E7在核苷酸水平上均存在變異，與國外文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。而與國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的HPVl6 E7“未發(fā)現(xiàn)變異”結(jié)論不同。這可能與樣本的大小、樣本的代表性、病人選擇標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、檢測方法等因素存在差異有關(guān)，此外，亦不能除外與這一地區(qū)E7基因序列存在多態(tài)性有關(guān)。地區(qū)HPVl6 E7還存在尚未見報(bào)道的突變位點(diǎn)，提示這一地區(qū)HPVl6變異具有多樣性；變異可能會增強(qiáng)其致癌性，提示為致癌預(yù)警信息；建議加強(qiáng)PVl6型E7內(nèi)變異株檢查，做好宮頸癌患者致癌預(yù)警工作，將為我國HPV基因變異與宮頸癌的關(guān)系提供更完善的理論依據(jù)。

[1]Das BC，Sharma JK，Gopalkrishna V，et a1．A Frequency of human papillomavirus DNA sequences incervical carcinomas of Indian women as revealed by southern blot hybridization and polymerase chain reaction[J]．JMed Virol 1992,36(4)：239．

[2]張志勇,施橋發(fā).人乳頭瘤病毒與宮頸癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(3):252-256.

[3]王長奇,王康,陳燕萍,等.HPV多重感染與宮頸病變關(guān)系的分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(2):166-168.

[4]左亞剛,王家璧,許雪梅,等.北京地區(qū)人乳頭瘤病毒 HPVFfiE7基因變異和序列分析[J].中華皮膚科雜志,2003;36:650．

[5]Mark HF．Integration of human papillomavirus sequences in cervicaltumor cell lines[J]．Ann Clin Izb Sci,1996,26：147.

[6]伍欣星,趙文先,丁曉華,等.湖北地區(qū)宮頸癌組織中人乳頭瘤病毒16型E7基因的分離、克隆和序列分析[J].中國病毒學(xué),1996,11:220．

[7]熊金虎,伍欣星,譚云.不同地區(qū)HPVl6E7基因的克隆及序列差異分析[J]．中國病毒學(xué),2002,17:211.

[8]許雪梅,司靜懿,劉世德,等.PRIVATE中國山東地區(qū)婦女宮頸癌組織中人乳頭瘤病毒16E6E7基因的分離、克隆和序列分析．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)1999;21:185.

[9]高慧,韓秋萍,黃正芳,等.揚(yáng)州地方株HPV16E7基因的克隆及序列分析.中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2005,21:(6)445.

[10]Paul KSC,ChingWL,Tak HC,et al.Human papillomavirus type 16 Variant infection and risk for cervical neoplasia in southern China[J]．Infet Dis,2002,186(5):696-700．