郭廣秀，張功亮，肖軍蘭，黃金長，王建

(贛州市人民醫(yī)院 病理科，江西 贛州 341000)

柯薩奇-腺病毒受體 (Coxsackie and adenovirious receptor，CAR)是柯薩奇 B病毒(CBV)和腺病毒(ADV)與靶細胞結(jié)合的共同受體。CAR因其作為腺病毒受體介導(dǎo)攜帶治療基因的腺病毒載體進入宿主細胞發(fā)揮治療作用而受到廣泛關(guān)注[1]。CAR作為細胞間粘附分子，參與了多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理過程[2]。本文應(yīng)用免疫組化方法檢測CAR在肺癌和癌旁組織中的表達情況，并分析其與臨床病理因素之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般材料 收集2009年1月至2012年12月我院病理診斷明確的肺癌手術(shù)切除標本70例、支氣管鏡活檢標本5例，其中鱗癌43例，腺癌27例，小細胞癌5例。同時采用癌旁(距離癌腫5cm以外)組織作為對照組。所有組織均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定10h，石蠟包埋組織。

1.2 試劑 鼠抗人CAR單克隆抗體購買自美國Upstate公司，EnVision試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法及步驟 免疫組化EnVision法：觀察存檔肺癌及癌旁組織玻片，挑選對應(yīng)最佳蠟塊，4um切片，60℃考片1h，二甲苯脫蠟后置酒精，水化后置入PBS液，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用0.01M、pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，100℃15min，自然冷卻，CAR(1:100)一抗孵育，4℃過夜，0.01M、pH7.2～7.4PBS 沖洗 10min， 再用 En-Vision 二抗孵育，37℃ 60min，0.01M、pH7.2～7.4PBS沖洗10min，DAB顯色(顯微鏡下觀察，及時終止顯色)，蘇木素襯染，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 所有切片均經(jīng)由兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師進行閱片、計數(shù)及判斷。隨機選擇5個高倍鏡視野(×400倍)，呈色強度得分：未染色0分，黃色1分，棕黃色2分，棕黑色3分。呈色百分率得分：無陽性細胞 0分，＜25%1分，25%～50%2分，＞50%3分。兩項得分相加即為CAR表達的最后得分：0 分為(-)，1～2 分為弱陽性(+)，3～4 分為中度陽性(++)，5～6 分為(+++)。表達程度分為：(-)和(+)為陰性表達，(++)和(+++)為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，應(yīng)用χ2檢驗對不同組織間CAR表達的差異進行比較，并分析其與臨床病理因素的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAR在肺癌及癌旁組織中的表達 CAR陽性定位于細胞膜上，胞漿內(nèi)少量表達，呈棕黃色顆粒狀。肺癌組織著色較深(++)～(+++)，多呈彌漫陽性(圖1)，而癌旁組織著色較淺，且呈灶性陽性(圖2)。

圖1 CAR在鱗癌組織中表達，呈彌漫陽性 SP法(×200)

圖2 CAR在癌旁組織中的表達，呈灶性陽性SP法(×200)

CAR在肺癌組織中的陽性表達率為57.3%(44/75)，癌旁組織中的陽性率 9.3%(7/75)，兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(見表1)。

表1 CAR在肺癌及癌旁組織中的表達[n(%)]

2.2 肺部組織CAR表達與臨床病理因素的關(guān)系在不同的臨床病理因素中，CAR的表達在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但在患者不同性別、年齡、吸煙與否、腫瘤大小、TNM分期等因素中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。CAR在腺癌及小細胞癌中的表達陽性率分別為74.1%(20/27)、80.0%(4/5)，而鱗癌僅為46.5%(20/43)，三者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見表 2)。

2.3 CAR的表達在肺鱗癌及腺癌不同組織學(xué)分級中的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0．05)(見表3)。

3 討論

柯薩奇-腺病毒受體(CAR)是分子量為45KD的Ⅰ型跨膜單倍，能夠介導(dǎo)腺病毒與靶細胞的結(jié)合，在以腺病毒為載體的基因治療領(lǐng)域起著重要作用[3]。CAR表達具有組織特異性和物種特異性[4]，在人類胰腺、腦、心臟、小腸、睪丸以及前列腺中含量最高，在肝臟和肺中有少量表達，而在腎臟、胎盤、末梢血白細胞，胸腺和脾臟中則無。CAR作為細胞間粘附分子，可能參與了多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理過程，在多種腫瘤細胞中CAR表達均有不用程度的降低或缺失，并且隨著腫瘤的惡性度增高，CAR的表達丟失更明顯。Jonas等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CAR在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達下調(diào)，Ⅱ期和Ⅲ期腫瘤CAR表達高于Ⅳ期，其間差異明顯。在前列腺組織中，CAR無論是在表達強度還是表達率上都較正常前列腺組織發(fā)生明顯下調(diào)，且隨著腫瘤惡性程度的升高，其下調(diào)也愈明顯。在膀胱尿路上皮癌也出現(xiàn)類似現(xiàn)象，而且CAR表達水平與腫瘤的病理分級、肌層侵犯、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及P53表達密切相關(guān)。然而，近來的研究發(fā)現(xiàn)[6]，在大多數(shù)骨肉瘤細胞系中CAR高度表達。Ito等發(fā)現(xiàn)鼠骨折模型中非成熟的成骨細胞亦有CAR的高水平表達。另外，所有的Ewing氏肉瘤細胞系都有CAR的高表達。所以我們可以看出，CAR在不同類型腫瘤中發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，在有些腫瘤中扮演了抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及侵襲的角色，而在另一些腫瘤中發(fā)揮著相反的作用。Qin等[7,8]發(fā)現(xiàn)在體外試驗表面CAR表達有利于非小細胞肺癌的形成，同時預(yù)示在體內(nèi)CAR的表達在腫瘤的增殖中是必須的，并且激發(fā)肺癌細胞某種亞型的有效形成中也是必須的。以腺病毒為載體的基因治療由于具有技術(shù)成熟、操作簡便和安全性好等優(yōu)點，進展尤為迅速。在本研究中，肺癌組織中CAR的表達水平顯著高于癌旁組織，提示CAR在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。但CAR的表達在肺鱗癌、腺癌不同組織學(xué)分級中的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明CAR的表達可能與肺鱗癌及腺癌惡性程度無明顯相關(guān)性。

表2 肺癌組織CAR表達與臨床病理因素的關(guān)系[n(%)]

表3 鱗癌及腺癌不同組織學(xué)分級中CAR表達比較[n(%)]

CAR為細胞表面的病毒受體，在細胞粘附、上皮細胞極性形成以及細胞的接觸抑制機制等方面起著重要作用，并可以抑制腫瘤的惡性進程及侵襲轉(zhuǎn)移[9]。本研究結(jié)果表明，在不同的臨床病理因素中，CAR的表達在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中有統(tǒng)計學(xué)差異，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例CAR表達的陽性率較低，說明CAR在一定程度上抑制了肺癌細胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。但在患者不同性別、年齡、吸煙與否、腫瘤大小等因素中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。值得注意的是，TNM分期中Ⅰ~Ⅱ期CAR陽性表達率較高(66.7%，28/42)，Ⅲ~Ⅳ期陽性率較低(48.5%，16/33)，說明CAR的表達與肺癌的TNM分期可能有一定的關(guān)系，即TNM分期越晚，CAR表達越不顯著，但尚未達到有統(tǒng)計學(xué)差異的程度，分析其原因可能為：肺癌TNM分期不單與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，還與腫瘤大小及是否有遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，這幾個因素都會對統(tǒng)計學(xué)結(jié)果產(chǎn)生影響，也有可能與本研究樣本量較小有關(guān)，更為精確的統(tǒng)計學(xué)分析有待于今后擴大樣本進一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CAR在不同組織類型的肺癌細胞中表達存在統(tǒng)計學(xué)差異，腺癌及小細胞癌的CAR表達明顯強于鱗癌的表達，說明CAR的表達與腫瘤細胞起源有關(guān)，并與肺腺癌及小細胞癌形成發(fā)展關(guān)系更為密切，與顧安康[10]、鮑永儀等[11]的報道一致，這將為我們選擇靶向藥物或基因治療不同組織學(xué)類型的肺癌提供一定的理論依據(jù)。

本研究不足之處：本研究屬于小樣本分析，更為精確的結(jié)果有待于更大樣本的研究。另外關(guān)于CAR對肺癌細胞具體的作用機制還不清楚，CAR與肺癌的增殖指數(shù)及預(yù)后等的關(guān)系還有待于進一步研究。

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