羅永慧，段穎卿，甘雪華，王旭菲，舒向榮

(江西省婦幼保健院，江西 南昌330008)

人型支原體(Mycoplasma hominis，Mh)是泌尿生殖道感染的常見病原體[1，2]。氟喹諾酮類藥物因具有較強(qiáng)的抗支原體活性而廣泛應(yīng)用于支原體感染的臨床治療。但近年來,Mh對(duì)該類藥物的耐藥性日益增加。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)針對(duì)Mh拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅣParE基因的特異性引物,對(duì)耐氟喹諾酮類藥物Mh株P(guān)arE基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，了解本地區(qū)臨床Mh株P(guān)arE基因突變與耐氟喹諾酮類藥物的關(guān)系，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 選取從泌尿生殖道分泌物中分離的8株對(duì)4種氟喹諾酮類藥物呈不同耐藥的Mh為研究對(duì)象。Mh的培養(yǎng)、鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)判斷方法見操作說明,所用試劑為珠海迪爾生物公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與試劑 電泳儀、電泳槽系美國(guó)BIORAD公司產(chǎn)品，PCR儀系珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。PCR系列試劑、DNA marker為New England Biolabs公司產(chǎn)品。

1.3 檢測(cè)方法

1.3 .1引物設(shè)計(jì)和合成 采用Bebear等[3]設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，ParE基因的上游引物為 5′-CTTTCAGGAAAATTAACTCCT-3′，下游引物為 5′-ATCAGTGTCAGCATCTGTCAT-3′,引物由上海生工公司合成。

1.3 .2耐藥菌株DNA模板制備 取耐藥菌株培養(yǎng)物500μl，12000r/min離心20min,棄上清液，沉淀物中加入標(biāo)本裂解液，100℃水浴 10min，12000r/min離心5min后取上清液作為DNA模板。

1.3 .3 ParE-PCR擴(kuò)增 將dNTP、MgCl2、 上下游引物、模板DNA和DNA聚合酶分別加入到反應(yīng)管中，反應(yīng)體系50μl，充分混勻后行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為92℃預(yù)變性10min后進(jìn)入循環(huán)，92℃60s,57℃60s,72℃120s, 共 40個(gè)循環(huán)后再 72℃450s，終止反應(yīng)。取擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，保存擴(kuò)增產(chǎn)物備用。

1.3 .4序列測(cè)定及基因序列比對(duì) PCR擴(kuò)增后的目的片段經(jīng)回收、純化后，以PE公司產(chǎn)的ABI310型自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)DNA序列。所測(cè)序列與野生株MHPG21的ParE基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1臨床分離的Mh菌株對(duì)氟喹諾酮類藥物的藥敏結(jié)果 采用肉湯稀釋法檢測(cè)臨床分離的Mh對(duì)4種氟喹諾酮類藥物的藥敏結(jié)果，并對(duì)這些菌株的耐藥表型與ParE基因所編碼的氨基酸殘基變異進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

表11 MM hh菌株對(duì)44種氟喹諾酮類藥物的藥敏結(jié)果及ParE基因編碼的氨基酸變異

2.2 ParE基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得Mh菌株P(guān)arE基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在約297bp處有特異性擴(kuò)增條帶 ，與引物預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物相符合,結(jié)果見圖1。

圖1 ParE基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 ParE基因擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序 將ParE-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)PUBMED數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析，臨床所分離的Mh耐藥株中，有6株檢出對(duì)應(yīng)于野生株 (PG21)ParE基因所編碼氨基酸序列426位D(Asp天冬氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)镹(Asn天冬酰胺)。

3 討論

氟喹諾酮類藥物因具有較強(qiáng)的抗支原體活性而廣泛應(yīng)用于支原體感染的臨床治療，其機(jī)理主要是作用于支原體DNA螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，通過阻止DNA復(fù)制、修復(fù)、染色體的分離、轉(zhuǎn)錄及其他功能，達(dá)到殺菌的目的。DNA螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ分別由GyrA、GyrB和ParC、ParE兩組基因編碼。這兩組基因若發(fā)生變異，相應(yīng)氨基酸改變，導(dǎo)致靶酶改變，將阻止氟喹諾酮類藥物進(jìn)入作用區(qū)，從而產(chǎn)生耐藥性。

對(duì)Mh耐氟喹諾酮類藥物的分子機(jī)制研究，國(guó)內(nèi)外報(bào)道主要是體外篩選誘導(dǎo)耐藥株，并對(duì)相關(guān)基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，以發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)性氨基酸變異。國(guó)內(nèi)對(duì)GyrA基因變異與Mh耐氟喹諾酮類藥物的相關(guān)性報(bào)道較多，而對(duì)Mh臨床分離株P(guān)arE基因變異與其耐氟喹諾酮的相關(guān)性研究甚少[4，6]。Bebear等[3]率先對(duì) Mh 參考株 PG21的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ亞單位ParC和ParE基因進(jìn)行克隆并測(cè)序。隨后作了系統(tǒng)的研究，對(duì)Mh參考株P(guān)G21進(jìn)行體外藥物誘導(dǎo)，然后檢測(cè)篩選株中GyrA、GyrB和ParC、ParE基因的變異情況，研究說明了DNA螺旋酶是司帕沙星作用的原始靶位,而拓?fù)洚悩?gòu)酶IV是氧氟沙星、環(huán)丙沙星和培氟沙星作用的原始靶位。對(duì)于Mh臨床分離株的檢測(cè),研究顯示除GyrA基因變異外，同樣存在ParC和ParE基因的變異[7]。張冉等[8]將MHPG21藥物誘導(dǎo)后進(jìn)行ParE基因突變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)誤義突變主要存在70位的G→A，導(dǎo)致其編碼的426位天冬氨酸被天冬酰胺取代；提示ParE基因中的點(diǎn)突變可能是耐藥機(jī)制的一部分。

本研究中對(duì)氧氟沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星多種藥物耐藥或中介的6株Mh臨床分離株中檢出ParE基因所編碼的氨基酸426位D(Asp天冬氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)镹(Asn天冬酰胺),這一突變與以往報(bào)道的對(duì)Mh誘導(dǎo)株和臨床分離株結(jié)果相一致[8,9]；還有2株未檢測(cè)出氨基酸變異，其耐藥性可能與別的耐藥機(jī)制有關(guān)；結(jié)果表明本地區(qū)的Mh臨床流行耐藥株的耐藥性可能與ParE基因所編碼的氨基酸殘基發(fā)生D426→N變異有關(guān)。氨基酸變異導(dǎo)致的耐藥可能為取代的氨基酸與被取代的氨基酸所帶電荷不同,極性上有差別,或結(jié)構(gòu)相差較大,或羥基殘基丟失等,使得相應(yīng)蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)改變,影響了酶與氟喹諾酮類藥物的結(jié)合。

總之，正確認(rèn)識(shí)人型支原體耐氟喹諾酮類藥物的發(fā)生機(jī)制,對(duì)臨床合理選用抗生素,減少耐藥性的發(fā)生,有效控制支原體感染具有重要意義。

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