張雪君 王寶維 葛文華 張名愛 岳 斌 史雪萍 王 鑫 徐晨晨

錳(manganese，Mn)廣泛存在于自然界，諸如土壤、礦物質(zhì)、植物和深海巖床等，也是機(jī)體必需的微量元素。錳的主要營(yíng)養(yǎng)生理作用是在碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)和膽固醇代謝中作為酶的活化因子或組成部分。錳具有促進(jìn)生長(zhǎng)和增強(qiáng)免疫作用，家禽機(jī)體內(nèi)氧化還原過程、組織呼吸、骨骼的形成與增長(zhǎng)、繁殖、胚胎發(fā)育、血液的形成、蛋殼形成及內(nèi)分泌器官的正常功能均離不開錳［1－3］?？梢?，錳在家禽營(yíng)養(yǎng)中具有不可替代的重要作用。此外，錳缺乏易引起骨形成障礙、骨短粗、滑腱癥等營(yíng)養(yǎng)缺乏病，動(dòng)物攝入過量錳也會(huì)引發(fā)疾?。?］。因此，研究家禽錳的需要量對(duì)養(yǎng)禽業(yè)具有重要意義。羅緒剛等［5］對(duì)肉仔雞試驗(yàn)表明，補(bǔ)錳試驗(yàn)組總膽固醇含量高于對(duì)照組，表明錳缺乏使膽固醇的合成作用降低。袁慧等［6］認(rèn)為不同組織器官中錳含量各不相同，其中肝臟中錳含量最高，其次為胰臟和心臟，血清中最低。張日?。?］、吳建設(shè)［8］研究表明，不同水平的錳影響免疫器官抗氧化酶的活性和脂質(zhì)過氧化物的生成。有機(jī)微量元素在吸收過程中而且可能在吸收后的代謝不同于其無機(jī)鹽，具有較高的生物利用率［9］。Ferket等［10］表明，飼糧中添加羥基蛋氨酸螯合錳能夠降低火雞脛骨軟骨發(fā)育異常癥、跛足以及增加骨骼破裂強(qiáng)度。然而，有關(guān)錳對(duì)機(jī)體抗氧化影響的研究報(bào)道很少。迄今為止，家禽錳需要量的研究主要集中在雞、鴨等禽類［11］，而鵝的錳需要量研究較少。為此，本試驗(yàn)以5～16周齡五龍鵝為試驗(yàn)對(duì)象，通過探索飼糧錳添加水平對(duì)血清生化指標(biāo)、組織錳沉積量、抗氧化能力及脛骨發(fā)育的影響，旨在為確定鵝飼糧中適宜錳添加水平提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇5周齡健康種用型五龍鵝(豁眼鵝)360只，采用隨機(jī)分配編號(hào)法，設(shè)計(jì)6個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只(公母各占1/2)。各組分別在基礎(chǔ)飼糧(錳含量為20.00 mg/kg)中分別添加0(Ⅰ組)、30(Ⅱ組)、60(Ⅲ組)、90(Ⅳ組)、120(Ⅴ組)、150 mg/kg(Ⅵ組)的錳。Ⅰ組為對(duì)照組，試驗(yàn)期12周。試驗(yàn)鵝由國(guó)家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系示范基地萊陽天森豁眼鵝繁育中心提供。試驗(yàn)用的1個(gè)結(jié)晶水硫酸錳購自浙江新維普添加劑有限公司(有效成分為98.00%)。

1.2 試驗(yàn)飼糧

基礎(chǔ)飼糧營(yíng)養(yǎng)水平參照NRC(1994)家禽營(yíng)養(yǎng)需要量設(shè)計(jì)配方，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)前對(duì)鵝舍進(jìn)行全面消毒，全期采取舍飼，地面厚墊料分欄飼養(yǎng)。試驗(yàn)鵝自由飲水和采食，少添勤喂，每日觀察鵝群的生長(zhǎng)狀況并對(duì)日采食量進(jìn)行記錄。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 血清生化指標(biāo)

16周齡末，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取2只五龍鵝，共72只(公母各占1/2)，翅下靜脈采血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液。采用堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒測(cè)定血清中堿性磷酸酶的活性;采用甘油三酯測(cè)定試劑盒測(cè)定血清中甘油三酯含量;采用總膽固醇測(cè)定試劑盒測(cè)定血清中總膽固醇含量;所用試劑盒均來自南京建成生物工程研究所。

1.4.2 組織錳沉積量

16周齡末，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取2只五龍鵝，共72只(公母各占1/2)，采集組織樣前五龍鵝禁食12 h。翅下靜脈采血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液。解剖采集心臟、肝臟和胰臟，剔除上面附著的組織，用3次蒸餾水沖洗，超低溫保存待測(cè)。將心臟、肝臟和胰臟置于75℃烘箱中，烘至恒重，所得的樣品經(jīng)研缽研磨粉碎，制成細(xì)末樣品。精確稱取0.250 g已烘干的樣品，置于凱氏燒瓶中，加入10.0 mL硝酸和2.5 mL高氯酸，置控溫電爐上消化至無白煙、無回流時(shí)，冷卻。將消化后的液體樣品無損失地轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至25 mL。采用原子吸收分光光度計(jì)分別進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 抗氧化能力

16周齡末，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)取2只五龍鵝，共72只(公母各占1/2)，翅下靜脈采血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液。采用總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒測(cè)定血清中的T-AOC;采用丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒測(cè)定血清中的MDA含量;采用谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)測(cè)定試劑盒測(cè)定血清中GSH-Px活性。

1.4.4 脛骨發(fā)育

16周齡末，分別從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取2只試驗(yàn)鵝，共72只(公母各占1/2)，屠宰后分離左、右脛骨。右側(cè)脛骨采用數(shù)字閃爍式錐形掃描骨密度儀(osteocore 3)測(cè)定骨密度(bone mineral density，BMD)，采用WD－1型電子萬能試驗(yàn)機(jī)測(cè)定骨強(qiáng)度，然后105℃烘干后稱重脛骨重量，再依據(jù)GB/T 6438—92、KMnO4氧化還原測(cè)定法(GB 6436—86)、鉬黃比色法(GB 6437—86)和原子吸收法分別測(cè)定脛骨中粗灰分、鈣、磷、錳含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件中單因素方差分析(oneway ANOVA)中的LSD法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05 和 P＜0.01分別為差異顯著和極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧錳添加水平對(duì)五龍鵝血清生化指標(biāo)的影響

由表2可知，16周齡末，飼糧錳添加水平對(duì)血清堿性磷酸酶活性及甘油三酯、總膽固醇含量影響不顯著(P＜0.05)，但有先升高后降低的趨勢(shì)，其中，Ⅴ組的堿性磷酸酶活性及甘油三酯、總膽固醇含量最高。

表2 飼糧錳添加水平對(duì)五龍鵝血清生化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of dietary manganese supplemental level on serum biochemical indexes of Wulong geese

2.2 飼糧錳添加水平對(duì)五龍鵝組織錳沉積量的影響

由表3可知，16周齡時(shí)，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組血清中錳的沉積量極顯著高于Ⅰ組(P＜0.01)，Ⅱ、Ⅲ組顯著高于Ⅰ組(P＜0.05);Ⅳ、Ⅴ組心臟和肝臟中錳的沉積量極顯著高于Ⅰ組(P＜0.01)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ組顯著高于Ⅰ組(P＜0.05);Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組胰臟中錳的沉積量顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組間差異不顯著(P＞0.05)。肝臟中錳的沉積量最大，胰臟和心臟中次之，血清中最低。

由此表明，飼糧中錳添加水平高于90 mg/kg時(shí)對(duì)五龍鵝組織錳沉積量有顯著影響。

2.3 飼糧錳添加水平對(duì)五龍鵝抗氧化能力的影響

由表4可知，T-AOC和GSH-Px活性均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，MDA含量呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)。Ⅴ組T-AOC極顯著高于Ⅰ組(P＜0.01)，Ⅳ組顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ組與Ⅰ組差異不顯著(P＞0.05);Ⅳ、Ⅴ組MDA含量極顯著低于Ⅰ、Ⅱ組(P＜0.01)，Ⅲ、Ⅵ組顯著低于Ⅰ、Ⅱ組(P＜0.05);Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組 GSH-Px活性極顯著高于Ⅰ組(P＜0.01)，Ⅱ、Ⅲ組顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)。

由此表明，飼糧中錳添加水平為90～120 mg/kg時(shí)能顯著提高T-AOC和GSH-Px活性，并顯著降低MDA含量。

表3 飼糧錳添加水平對(duì)五龍鵝組織錳沉積量的影響Table 3 Effects of dietary manganese supplemental level on tissue manganese deposition of Wulong geese

表4 飼糧錳添加水平對(duì)五龍鵝抗氧化能力的影響Table 4 Effects of dietary manganese supplemental level on antioxidant ability of Wulong geese

2.4 飼糧錳添加水平對(duì)五龍鵝脛骨發(fā)育的影響

由表5可知，Ⅴ組骨密度顯著高于Ⅰ組(P＜0.05);Ⅴ組骨強(qiáng)度、骨重和粗灰分含量極顯著高于Ⅰ組(P＜0.01)，Ⅳ、Ⅵ組顯著高于Ⅰ組(P＜0.05);Ⅴ組鈣含量極顯著高于Ⅰ組(P＜0.01)，其他各組均顯著高于Ⅰ組(P＜0.05);Ⅴ組磷含量極顯著高于Ⅰ組(P＜0.01)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ組顯著高于Ⅰ組(P＜0.05);Ⅴ組錳含量極顯著高于Ⅰ組(P＜0.01)，Ⅳ、Ⅵ組顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)。Ⅰ、Ⅱ組間骨密度、骨強(qiáng)度、骨重及粗灰分、磷、錳含量無顯著差異(P＞0.05)。

由此表明，飼糧中錳添加水平為90～120 mg/kg時(shí)對(duì)骨強(qiáng)度、骨重及粗灰分、鈣、磷、錳含量有顯著影響。

表5 飼糧錳添加水平對(duì)五龍鵝脛骨發(fā)育的影響Table 5 Effects of dietary manganese supplemental level on tibia development of Wulong geese

3 討 論

3.1 飼糧錳添加水平對(duì)五龍鵝血清生化指標(biāo)的影響

甘油三酯與動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育及免疫系統(tǒng)有關(guān)，其含量變化反映了體內(nèi)膜類代謝情況。羅緒剛等［5］研究表明，機(jī)體為了彌補(bǔ)缺錳時(shí)血液膽固醇含量的下降而自動(dòng)調(diào)節(jié)脂蛋白的分解，而來自被分解脂蛋白的甘油三酯使得血漿中的甘油三酯含量得以提高。膽固醇是細(xì)胞膜成分，血液中的膽固醇一部分到組織中構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分;另一部分轉(zhuǎn)變?yōu)橹匾墓檀佳苌锞S生素D3，促進(jìn)鈣的吸收或類固醇激素代謝。同時(shí)也有學(xué)者研究表明，體外肝細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)錳能促進(jìn)14C標(biāo)記的乙酸合成膽固醇，錳是甲羥戊酸激酶的輔助因子，錳缺乏使甲羥戊酸激酶活性受到抑制，從乙酸鹽到甲羥戊酸之間有2個(gè)部位需要錳離子(Mn2+);焦磷酸法呢酯合成酶需要Mn2+，焦磷酸法呢酯合成受阻會(huì)抑制鯊烯的產(chǎn)生而使膽固醇合成受阻。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨飼糧錳添加水平升高，血清甘油三酯含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，飼糧添加90 mg/kg錳時(shí)血清甘油三酯含量最高;補(bǔ)錳組總膽固醇含量高于對(duì)照組，表明錳缺乏使膽固醇的合成作用降低。

3.2 飼糧錳添加水平對(duì)五龍鵝組織錳沉積量的影響

肝臟微量元素含量是反映機(jī)體對(duì)微量元素吸收情況的重要指標(biāo)。二價(jià)金屬離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體(DMT1)是腸道錳吸收載體，Bai等［12］認(rèn)為，其表達(dá)的程度與錳源特性密切相關(guān)。羅緒剛等［13］認(rèn)為，心肌錳含量可用來評(píng)價(jià)肉仔雞對(duì)飼糧錳水平的變化。折永勝等［14］研究表明，胰臟和心肌錳含量隨飼糧錳添加水平的升高而明顯升高。張建云等［15］研究表明，蛋雞組織器官中的錳含量隨飼糧錳添加水平的提高而顯著增加。王彥平等［16］研究表明，不同錳添加水平顯著影響心肌錳含量。動(dòng)物對(duì)飼糧錳的吸收率非常低，家禽對(duì)錳的吸收發(fā)生在十二指腸，所吸收的錳進(jìn)入血液后，迅速分布到肝、骨和毛中，而肝、骨和毛成為錳的主要貯存場(chǎng)所。在一般的情況下，錳在動(dòng)物體內(nèi)是通過膽汁排泄的，但也可以通過胰臟排泄。袁慧等［6］研究表明，錳在各個(gè)組織器官中的沉積量各不相同，其中，肝臟中錳沉積量最高，其次為胰臟和心臟中，血清中最低。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧錳添加水平顯著影響肝臟和心肌錳沉積量。隨著錳添加水平的提高，肝臟錳沉積量也隨之提高，表明肝臟錳沉積量可以作為機(jī)體錳營(yíng)養(yǎng)判定的敏感指標(biāo)。不同組織器官中錳沉積量各不相同，其中，肝臟中錳沉積量最高，其次為胰臟和心臟中，血清中最低。這個(gè)結(jié)果與袁慧等［6］的研究結(jié)果一致。這也進(jìn)一步說明錳在動(dòng)物組織中的分布與其組織代謝特點(diǎn)有關(guān)。在不同部位的同一類組織中，由于其生理機(jī)能和代謝水平的不同，錳在其中的分布也有很大差異。

3.3 飼糧錳添加水平對(duì)五龍鵝抗氧化能力的影響

家禽代謝旺盛，易產(chǎn)生很多自由基，尤其是在規(guī)模化養(yǎng)殖條件下，易受各種不良環(huán)境的應(yīng)激影響，因而更易使體內(nèi)自由基的平衡狀態(tài)受到破壞，對(duì)疫病的易感性增加。因此，與哺乳動(dòng)物相比，肉鴨需要更為強(qiáng)大的抗氧化體系來清除體內(nèi)易過多積累的自由基，以維持體內(nèi)自由基的穩(wěn)定和平衡，從而維持其健康和正常生長(zhǎng)。其中錳與家禽的抗氧化能力有密切關(guān)系，錳的供給有特殊的重要性［17］。錳是過氧化物歧化酶(SOD)的活性組成成分，同時(shí)也會(huì)影響組織非酶抗氧化蛋白的生成。動(dòng)物錳的營(yíng)養(yǎng)狀況影響機(jī)體組織的抗氧化狀況［18］。有機(jī)微量元素增加了生物可利用微量元素水平，可能增加了金屬抗氧化酶的活性及抗氧化蛋白的合成，從而增加了組織抗氧化能力，降低了自由基的損傷，動(dòng)物錳的營(yíng)養(yǎng)狀況影響機(jī)體組織的抗氧化狀況及氧化應(yīng)激程度。

T-AOC是用于衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)，體現(xiàn)了體內(nèi)多種抗氧化酶共同作用的效果，T-AOC的高低可以直接反映出機(jī)體面對(duì)外來刺激時(shí)抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的應(yīng)對(duì)能力［19］。當(dāng)動(dòng)物飼糧中銅缺乏時(shí)機(jī)體的抗氧化機(jī)能降低，在一定范圍內(nèi)適當(dāng)提高飼糧中銅水平可有效提高動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力，但動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力并非隨飼糧中銅水平增加而呈線性上升［20］。MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，主要由體內(nèi)酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的自由基與細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸共同反應(yīng)產(chǎn)生，可直接反映機(jī)體內(nèi)氧化自由基的水平以及細(xì)胞被攻擊損傷的程度。GSHPx是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，是機(jī)體抗過氧化能力指標(biāo)之一［21］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧錳添加水平為90～120 mg/kg時(shí)能顯著提高T-AOC和GSH-Px活性，并顯著降低MDA含量。

3.4 飼糧錳添加水平對(duì)五龍鵝脛骨發(fā)育的影響

錳是與畜禽骨骼生長(zhǎng)密切相關(guān)的微量元素之一，家禽飼糧中錳缺乏時(shí)骨骼組織形成紊亂，常發(fā)生軟腿病。骨中錳含量是評(píng)價(jià)錳生物學(xué)效價(jià)最敏感的指標(biāo)。Ferket等［10］研究表明，火雞飼糧中添加羥基蛋氨酸螯合錳能夠降低脛骨軟骨發(fā)育異常癥、跛足以及增加骨骼破裂強(qiáng)度。羅緒剛等［22］試驗(yàn)表明，在肉用雛雞豆粕基礎(chǔ)飼糧中分別添加40、70、100、200和 2 000 mg/kg的錳，飼糧錳添加水平在200 mg/kg以內(nèi)各組的增重和飼料轉(zhuǎn)化率無差異，但滑腱癥的發(fā)生率隨飼糧錳添加水平的提高而下降。有資料報(bào)道，以玉米－豆粕為基礎(chǔ)飼糧的肉雞在3周時(shí)，腿病發(fā)生率為75.0%;飼糧錳添加到25 mg/kg時(shí)，可降低到27.2%;而飼糧錳添加到100 mg/kg 時(shí)，腿病發(fā)生率僅為 5.0%［23］，從而可證實(shí)玉米、豆粕中錳含量遠(yuǎn)低于肉雞的營(yíng)養(yǎng)需要量。由于飼糧中錳水平不足，使機(jī)體中錳含量缺乏，影響了骨骼中軟骨的基質(zhì)合成，使機(jī)體組織內(nèi)的己糖胺和己糖醛酸的含量下降，從而影響硫酸軟骨素的合成，使黏多糖合成受阻，從而發(fā)生骨骼病變，臨床上表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫大和脫腱癥。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中錳添加水平為90～120 mg/kg時(shí)能顯著提高脛骨密度、骨強(qiáng)度、骨重及鈣、錳含量，說明添加錳有利于促進(jìn)脛骨的發(fā)育，進(jìn)而促進(jìn)五龍鵝生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

①飼糧中適宜錳添加水平能夠顯著影響五龍鵝組織錳沉積量，提高機(jī)體抗氧化能力，對(duì)脛骨強(qiáng)度、骨重及粗灰分、鈣、磷、錳含量有顯著影響，對(duì)血清生化指標(biāo)無顯著影響。

②建議5～16周齡五龍鵝飼糧中錳添加水平為 90～120 mg/kg。

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