韓 旭 田柳青 王子龍 顏偉玉 曾志將 吳小波

蜜蜂是一種變態(tài)發(fā)育的社會性昆蟲，需經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹和成蜂4個階段［1］。在正常條件下，由3～12日齡的哺育蜂為蜜蜂幼蟲提供蜂王漿或蜂糧等食物，滿足其對各種營養(yǎng)物質(zhì)的需求［2］。成年蜜蜂在不同環(huán)境、日齡及勞動分工中，所需的營養(yǎng)差異很大。然而，充足均衡的營養(yǎng)對蜜蜂正常的生長發(fā)育和代謝有著重要意義。維生素C是一種水溶性的抗氧化劑，在生物體的有氧代謝過程中能夠保護(hù)機體免于氧化劑的威脅，在機體的抗氧化過程中發(fā)揮著重要的作用［3］。維生素C作為自由基清除劑，能與超氧陰離子自由基(O2－·)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)結(jié)合，生成抗壞血酸自由基，同時它也可以清除單線態(tài)氧，從而保護(hù)機體免受內(nèi)源性氧自由基的損傷［4］。維生素C也是蜜蜂生長發(fā)育、繁殖以及維持正常的生命活動不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)［5］。研究表明，維生素C是蜜蜂機體內(nèi)重要的抗氧化因子，具有極強的抗氧化能力，是蜜蜂維持正常生命特征的重要保障。早在1990年，劉富海［6］的研究就表明，在蜜蜂飼糧中添加適量的維生素C可延長蜜蜂的壽命。維生素C也能有效刺激蜜蜂取食并對幼蟲及成蜂腺體發(fā)育有促進(jìn)作用［7］。

超氧化物歧化酶(SOD)是一類廣泛存在于動物、植物、微生物中的金屬酶，根據(jù)活性中心結(jié)合的金屬離子不同，可以分為銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)3類［8］，它們通過催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，進(jìn)而減輕或消除機體代謝過程中產(chǎn)生的過多的超氧陰離子自由基，在預(yù)防疾病、提高機體免疫力以及抗衰老、抗炎癥等方面發(fā)揮重要的作用［9］。研究表明，中華蜜蜂Cu/Zn-SOD基因在不同發(fā)育時期和不同部位均有表達(dá)特異性，而且在6日齡幼蟲中的表達(dá)量達(dá)到峰值，而在4日齡蛹中的表達(dá)量最低;頭部與腹部的表達(dá)量顯著高于胸部［10］。2013年，劉俊峰等［11］通過給剛出房的中華蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂飼喂不同濃度的維生素C，發(fā)現(xiàn)隨著維生素C濃度的升高，10日齡中華蜜蜂的死亡率顯著下降，Cu/Zn-SOD基因相對表達(dá)量也呈下降趨勢，但差異不顯著。然而，其試驗組只設(shè)計了2種濃度的維生素C，飼喂高濃度維生素C對蜜蜂生存能力的影響未見報道。鑒于此，本試驗擬在總結(jié)前人試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展維生素C對中華蜜蜂幼蟲發(fā)育及工蜂生存能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的中華蜜蜂。

1.2 主要試劑

Trizol總RNA提取試劑盒、RNA酶抑制劑購自全式金公司，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及SYBR GreenⅡ熒光定量試劑購自TaKaRa公司，維生素 C(25 g，濃度在99.0%以上)購自Sigma公司。

1.3 主要儀器

主要儀器有24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(賽業(yè)生物科技公司)、生化培養(yǎng)箱(GZ－250－GSI型，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備發(fā)展有限公司)、普通離心機(飛鴿KA－1000型，上海安亭科學(xué)儀器廠公司)、臺式冷凍離心機(5810R型，Eppendorf公司)、PCR儀(iQ TM2型，Bio-Rad公司)。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 蜜蜂幼蟲飼養(yǎng)試驗

將800只1日齡中華蜜蜂幼蟲隨機分為5組，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)20只。其中，對照組(Ⅰ組)飼喂基礎(chǔ)飼糧(表1)，基礎(chǔ)飼糧中維生素C含量為1.6 mg/kg;4個試驗組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添 加 10(Ⅱ 組)、20(Ⅲ 組)、30(Ⅳ 組)、40 mg/kg(Ⅴ組)維生素C的試驗飼糧，對應(yīng)的試驗飼糧中維生素 C 含量分別為 11.6、21.6、31.6、41.6 mg/kg。由于維生素C性質(zhì)不穩(wěn)定，容易被氧化分解，每天的飼糧現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 中華蜜蜂幼蟲基礎(chǔ)飼糧組成Table 1 Basal diet composition of larvae for Apis cerana cerana

1.4.2 工蜂飼養(yǎng)試驗

選取4群群勢相同的中華蜜蜂蜂群，隔王產(chǎn)卵，將即將出房的封蓋子放入恒溫恒濕(34℃，相對濕度為75%)的培養(yǎng)箱中羽化。將羽化出的1日齡中華蜜蜂工蜂分成4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)24 g(約300只)。其中，對照組(Ⅵ組)飼喂1∶1(蔗糖與水的質(zhì)量比)的糖水，3個試驗組分別在1∶1的糖水中添加 50(Ⅶ組)、500(Ⅷ組)、2 500 mg/kg(Ⅸ組)的維生素C。各組糖水現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.3 蜜蜂幼蟲飼養(yǎng)方法

用蒸餾水反復(fù)沖洗24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，然后用70%乙醇溶液消毒，再將培養(yǎng)板放于超凈工作臺中，打開紫外照射燈，通風(fēng)干燥5 h。將200μL幼蟲飼糧加入到培養(yǎng)板的每個孔中，并置于34℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱5 min。再用移蟲針將1日齡幼蟲從巢脾中移出，放入盛有營養(yǎng)液的培養(yǎng)板的孔內(nèi)，每孔2～4只，使幼蟲漂浮在營養(yǎng)液表面。移蟲完成后，將培養(yǎng)板放入恒溫恒濕(34℃，相對濕度為95%)的培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)。每12 h更換1次食物。每次飼喂300 mg幼蟲飼糧。第2天之后，飼養(yǎng)密度降低至1只幼蟲/孔。7～8日齡時能在培養(yǎng)板的孔底部看到尿素晶體和纖維狀物質(zhì)，說明幼蟲開始排便，準(zhǔn)備化蛹，此時，將大幼蟲轉(zhuǎn)移至化蛹培養(yǎng)板，并放入恒溫恒濕(34℃，相對濕度為75%)的培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)，直至蜜蜂出房。此期間是蜜蜂發(fā)育的敏感時期，避免移動化蛹培養(yǎng)板。

1.4.4 工蜂飼養(yǎng)方法

將1日齡工蜂以重復(fù)為單位隨機放入小木箱(11 cm×13 cm×15 cm)中，將小木箱放入恒溫恒濕(34℃，相對濕度為65%)的培養(yǎng)箱中繼續(xù)飼養(yǎng)。為避免應(yīng)激干擾帶來的影響，首次飼喂24 h后取出已死亡的蜜蜂，開始正式試驗。在前3天試驗中給予充足花粉，補充發(fā)育所需的營養(yǎng)。另外，每24 h更換1次食物，并記錄和清除已死亡的蜜蜂，直到蜜蜂全部死亡。

1.5 樣品采集

1.5.1 蜜蜂幼蟲飼養(yǎng)試驗

從每組的8個重復(fù)中各任意選出4個重復(fù)，每重復(fù)隨機選取發(fā)育正常的6日齡幼蟲、3日齡蛹以及剛羽化蜜蜂(1日齡成蜂)各5只，準(zhǔn)確稱重，計算其均值(幼蟲需用蒸餾水沖洗掉體表蜂王漿并用吸水紙擦干)。另外，從剩余的4個重復(fù)中，每重復(fù)隨機選取6日齡幼蟲、3日齡蛹以及剛羽化蜜蜂各3只，立即放入液氮速凍，－80℃保存，用于Cu/Zn-SOD基因相對表達(dá)量的測定。

1.5.2 工蜂籠養(yǎng)試驗

在各重復(fù)中選擇3個重復(fù)進(jìn)行采樣，不參與生存率的記錄和分析。每重復(fù)隨機采集3、9、15日齡工蜂各4只，以4只工蜂頭部作為1個樣品，取樣后立即放入液氮速凍，－80℃保存，用于Cu/Zn-SOD基因相對表達(dá)量的測定。

1.6 Cu/Zn-SOD基因相對表達(dá)量的測定

用Trizol總RNA提取試劑盒進(jìn)行樣品總RNA的提取。所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。將提取的總RNA溶于30μL RNA-free的焦磷酸二乙酯(DEPC)水中，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測后，放入－80℃保存。

用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為50μL:8μL總RNA，10μL Buffer，8μL dNTP，1.5 μL M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶，3 μL Oligo dT，1 μL RNA酶抑制劑，18.5μL DEPC水。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:體系混勻后，42℃反應(yīng)60 min，75℃反應(yīng)5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍后保存于－80℃。

采用DNAMAN 5.0設(shè)計引物，引物序列見表2。實時定量PCR(RT-qPCR)反應(yīng)體系為10μL:1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，目的基因的上游和下游引物各0.4μL，5 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，3.2 μL ddH2O。PCR 擴增程序為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 10 s，58.9 ℃1 min，40個循環(huán);最后以每5 s上升0.5℃的速度從61℃升到95℃，記錄熔解曲線，每個反轉(zhuǎn)錄樣品重復(fù)測定3次。反應(yīng)結(jié)束后收集目的基因與內(nèi)參基因的循環(huán)數(shù)(Ct)值，用qPCR package的R軟件計算擴增效率，參考文獻(xiàn)［12］的方法計算目的基因的相對表達(dá)量。

表2 引物序列Table 2 Primer sequence

1.7 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier法的生存分析，采用StatView軟件“ANOVA and t-test”中的“ANOVA or ANCOVA”進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素C對中華蜜蜂幼蟲發(fā)育的影響

2.1.1 維生素C對中華蜜蜂幼蟲體重的影響

2.1.1.1 6 日齡幼蟲體重

由圖1可知，6日齡幼蟲的體重隨著飼糧中維生素C含量的增加先增加后降低，具體表現(xiàn)為Ⅱ和Ⅲ組顯著高于對照組(P＜0.05)，且Ⅱ和Ⅲ組還顯著高于Ⅴ組(P＜0.05)，但Ⅱ和Ⅲ組之間差異不顯著(P＞0.05)。

圖1 維生素C對6日齡幼蟲體重的影響Fig.1 Effects of vitamin C on body weight of 6-day-old larvae

2.1.1.2 3 日齡蛹體重

由圖2可知，3日齡蛹的體重隨著飼糧中維生素C含量的增加先增加后降低，具體表現(xiàn)為Ⅱ和Ⅲ組均顯著高于對照組(P＜0.05)，且Ⅱ和Ⅲ組還顯著高于Ⅳ和Ⅴ組(P＜0.05)，但Ⅱ和Ⅲ組之間差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 維生素C對3日齡蛹體重的影響Fig.2 Effects of vitamin C on body weight of 3-day-old pupae

2.1.1.3 剛羽化蜜蜂體重

由圖3可知，剛羽化蜜蜂體重隨著飼糧中維生素C含量的增加先增加后降低，具體表現(xiàn)為Ⅱ和Ⅲ組顯著高于對照組及Ⅳ和Ⅴ組(P＜0.05)，但Ⅱ和Ⅲ組之間差異不顯著(P＞0.05)。

2.1.2 維生素 C對中華蜜蜂幼蟲化蛹率和羽化率的影響

由圖4可知，中華蜜蜂幼蟲化蛹率及羽化率隨著飼糧中維生素C含量的增加均先上升后下降。在化蛹率方面，Ⅱ和Ⅲ組顯著高于對照組及Ⅳ和Ⅴ組(P＜0.05)，而Ⅱ和Ⅲ組之間差異不顯著(P＞0.05)。在羽化率方面，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組顯著高于對照組和Ⅴ組(P＜0.05)，但Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組之間差異不顯著(P＞0.05)。

圖3 維生素C對剛羽化蜜蜂體重的影響Fig.3 Effects of vitamin C on body weight of new emerged bees

圖4 維生素C對中華蜜蜂幼蟲化蛹率和羽化率的影響Fig.4 Effects of vitamin C on pupation rate and eclosion rate of larvae for Apis cerana cerana

2.1.3 維生素 C對不同階段中華蜜蜂幼蟲Cu/Zn-SOD基因相對表達(dá)量的影響

由圖5可知，中華蜜蜂幼蟲不同發(fā)育時期Cu/Zn-SOD基因的相對表達(dá)量均隨著飼糧中維生素C含量的增加先升高后降低。其中，各試驗組6日齡幼蟲和3日齡蛹Cu/Zn-SOD基因的相對表達(dá)量均顯著高于對照組(P＜0.05)，且以Ⅲ組的相對表達(dá)量最高。對于剛出房的1日齡成蜂的Cu/Zn-SOD基因的相對表達(dá)量，各組之間差異均不顯著(P＞0.05)。

2.2 維生素C對中華蜜蜂工蜂生存能力的影響

2.2.1 維生素C對工蜂平均壽命的影響

由表3可知，工蜂的平均壽命隨著飼糧中維生素C含量的增加先增加后減少，具體表現(xiàn)為各試驗組均顯著高于對照組(P＜0.05)，其中Ⅷ組的平均壽命最長，為24.204 d。分析工蜂的存活曲線(圖6)發(fā)現(xiàn)，添加維生素C的各試驗組工蜂的生存時間明顯長于對照組，而且Ⅷ組工蜂的存活率高于其他試驗組，存活的時間最長。

圖5 維生素C對不同階段中華蜜蜂幼蟲Cu/Zn-SOD基因相對表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of vitamin C on the relative expression level of Cu/Zn-SOD gene of larvae for Apis cerana cerana in different stages

表3 維生素C對工蜂平均壽命的影響Table 3 Effects of vitamin C on average lifespan of worker bees d

2.2.2 維生素 C對不同階段工蜂 Cu/Zn-SOD基因相對表達(dá)量的影響

由圖7可知，各日齡工蜂Cu/Zn-SOD基因的相對表達(dá)量均隨著飼糧維生素C含量的增加而減少，其中Ⅸ組3、9、15日齡工蜂以及Ⅷ組 9、15日齡工蜂Cu/Zn-SOD基因的相對表達(dá)量均顯著低于對照組(P＜0.05)。

圖6 維生素C對工蜂存活率的影響Fig.6 Effects of vitamin C on survival rate of worker bees

圖7 維生素C對不同階段工蜂Cu/Zn-SOD基因相對表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of vitamin C on the relative expression level of Cu/Zn-SOD gene of worker bees in different stages

3 討論

蜜蜂營養(yǎng)對蜜蜂正常生長與繁衍的重要作用，一直受到世界各國蜜蜂科研工作者的廣泛關(guān)注，特別是蜜蜂對維生素的需求，現(xiàn)已成為人們關(guān)注的焦點之一。維生素C作為具有抗氧化活性的水溶性維生素，對大部分植食性昆蟲是必不可少的，這也是這類昆蟲的特點［13］。在生物體的有氧代謝過程中，維生素C能夠保護(hù)機體免于氧化劑的威脅，在機體的抗氧化過程中發(fā)揮著重要的作用［3］。本試驗在飼糧中人工添加不同濃度的維生素C，分別飼喂中華蜜蜂幼蟲和剛出房的工蜂后發(fā)現(xiàn):添加適量維生素C可以提高幼蟲的體重、抗氧化能力和工蜂的生存能力，適量的維生素C能夠增加工蜂的壽命，飼糧中維生素C的含量過量反而降低工蜂的壽命，甚至有害健康。這與前人研究的結(jié)果［6，11］相符。這表明維生素C不僅是成年工蜂所必需的營養(yǎng)成分，同時也是幼蟲發(fā)育過程中必不可少的功能性營養(yǎng)物質(zhì)，對幼蟲正常的生長發(fā)育起著重要的作用。試驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，向幼蟲基礎(chǔ)飼糧中添加10和20 mg/kg維生素C的試驗組在6日齡幼蟲、3日齡蛹、剛羽化蜜蜂的體重以及化蛹率、羽化率方面均顯著高于對照組，表明蜜蜂幼蟲飼糧中維生素C的適宜含量為11.6～21.6 mg/kg。另外，飼喂中等濃度(500 mg/kg)維生素C后工蜂的平均壽命最長。然而，蜜蜂是典型的社會性昆蟲，以群體為單位，在對蜂群進(jìn)行人工飼養(yǎng)時，不可能對幼蟲和工蜂進(jìn)行單獨飼養(yǎng)。對蜂群飼喂不同含量的維生素C飼糧后，其工蜂分泌的蜂王漿和飼喂給幼蟲食物中維生素C含量有待于進(jìn)一步研究，從而最終確定蜂群對維生素C的營養(yǎng)需要量。

SOD是一種主要的抗氧化酶，它能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)而生成分子氧和過氧化氫，為清除氧自由基的第1道防線［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂添加維生素C飼糧后6日齡幼蟲和3日齡蛹Cu/Zn-SOD基因的相對表達(dá)量均顯著高于對照組，說明維生素C可以提高幼蟲的抗氧化能力。然而，在剛出房的工蜂中，Cu/Zn-SOD基因的相對表達(dá)量在各試驗組與對照組之間均差異不顯著，而且對剛出房的工蜂采用不同濃度維生素C飼糧進(jìn)行飼養(yǎng)后，其Cu/Zn-SOD基因的相對表達(dá)量隨著維生素C含量的增加而降低，飼喂添加高劑量(2 500 mg/kg)維生素C飼糧的工蜂Cu/Zn-SOD基因的相對表達(dá)量在3、9、15日齡均顯著低于對照組，可能是工蜂與幼蟲的抗氧化性能機制不同，也可能是長時間飼喂維生素C導(dǎo)致的。維生素C本身作為一種抗氧劑，在一定程度上可能替代了Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化作用，導(dǎo)致機體抗氧化基因的表達(dá)量下降，其具體的作用機理仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

①中華蜜蜂幼蟲人工飼糧中維生素C的適宜含量為 11.6～21.6 mg/kg。

②飼糧中維生素C含量對中華蜜蜂工蜂的生存能力有影響。

致謝:試驗中得到了江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所何旭江、王文祥等同學(xué)的支持和幫助，在此表示衷心的感謝。

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