姜 婧，高曉黎，馬桂芝，常占英

(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所，烏魯木齊 830002)

新疆是一個典型的大陸性氣候區(qū)，有著非常獨(dú)特的自然生態(tài)環(huán)境，水土光熱資源豐富，蘊(yùn)育著多樣性的生物品種資源，石榴作為新疆的特色林果業(yè)在國內(nèi)外享有盛譽(yù)。近年來，隨著國內(nèi)外掀起的石榴研究熱潮，石榴的多種功效引起了人們的廣泛關(guān)注。被人們使用了數(shù)個世紀(jì)的藥材石榴，如今被看作是非常具有潛力的化學(xué)預(yù)防和抗癌劑，其中抗腫瘤作用研究尤為重視，這說明石榴是一種很有開發(fā)前途的天然保健食品。本研究在以往對石榴皮提取物作用的研究基礎(chǔ)上，探究石榴皮提取物在體外對Caco-2細(xì)胞生長抑制作用，為以后的臨床應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 Caco-2人結(jié)腸癌細(xì)胞株購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。復(fù)蘇后經(jīng)培養(yǎng)傳至第三代，置于37 ℃、5%CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱孵育2～3 d，接種于96孔板。對復(fù)蘇培養(yǎng)后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定；肉眼觀察細(xì)胞形態(tài)及色澤；采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法在顯微鏡下鑒定。

1.2石榴皮水提物的制備 稱取20 g當(dāng)季新鮮石榴皮曬干后的粉末，加入240 mL水浸泡后煎30 min，過濾后減壓濃縮，浸膏冷凍干燥后得淺黃色至黃褐色粉末，采用不完全高糖DEME (dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)基(廠家：Hyclone；批號：NYA0793)溶解，終濃度為1，2，4，8 g/L，分別用P1，P2，P4，P8表示。

1.3用四氮唑藍(lán)比色法測定抑制率 取對數(shù)生長期人源性腫瘤細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%新生牛血清的roswell park memorial institute(RPMI)1640培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×107個/L接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL。將培養(yǎng)板放入CO2孵箱，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。待大部分細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)好的培養(yǎng)板取出，按照石榴皮水提取物濃度從低到高的順序，每個濃度設(shè)9個孔，同濃度1孔加20 μL提取液，陰性對照采用無藥血清，也設(shè)9個孔，每孔加20 μL無藥血清繼續(xù)培養(yǎng)。給藥24 h后，給每一種濃度提取液培養(yǎng)孔(包括陰性對照的9個孔)加入3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h；終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使二甲基亞砜充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸收值，記錄結(jié)果，按照以下公式計(jì)算24 h的細(xì)胞增殖抑制率。給藥后48、72 h時同樣處理，得出48 h和72 h的細(xì)胞增殖率，并對抑制率最高的時間組，應(yīng)用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，Probit回歸模式計(jì)算出該時間下的IC50值。

2 結(jié) 果

2.1腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇與鑒定 Caco-2細(xì)胞復(fù)蘇成功，培養(yǎng)后顯微鏡下觀察平板上均有細(xì)胞呈多邊形單層生長，細(xì)胞之間充分伸展相互聯(lián)系，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，符合Caco-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征(圖1)。

2.2石榴皮提取物對Caco-2細(xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果 經(jīng)消化傳代后，在連續(xù)觀察的8 d時間內(nèi)，前4 d Caco-2細(xì)胞保持增長態(tài)勢，在第4日達(dá)到細(xì)胞數(shù)最大值，第5日開始緩慢的負(fù)增長。加入石榴皮提取物后，顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，部分細(xì)胞收縮呈類圓形，有大量致密的顆粒物質(zhì)聚集于細(xì)胞膜下，細(xì)胞中部密度顯著降低幾乎觀察不到細(xì)胞核。細(xì)胞貼壁能力下降，細(xì)胞之間的連接減少，細(xì)胞與細(xì)胞之間幾乎不能連接成片而出現(xiàn)空隙(圖2)。

圖1 Caco-2細(xì)胞形態(tài)(倒置顯微鏡，×200)

圖2 Caco-2加入8 g/L石榴皮提取物 后顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)(倒置顯微鏡，×100)

不同濃度的石榴皮提取物在不同時間對Caco-2細(xì)胞增殖的影響，相同濃度下，隨著提取物作用時間的延長，對Caco-2細(xì)胞的抑制率呈上升趨勢，尤其在高濃度時，這種上升趨勢越明顯，其低濃度提取物抑制率與時間依賴性不十分明顯(圖3)。相同時間下，不同濃度石榴皮提取物的增殖抑制能力有較為明顯的區(qū)別，結(jié)果表明基本上濃度越高，抑制能力越強(qiáng)(圖4)。石榴皮提取物在8 g/L時對Caco-2細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，24、48、72 h的細(xì)胞生長抑制率分別為(50.65±5.18)%、(57.21±2.07)%、(69.88±2.14)%，說明72 h時間內(nèi)，作用時間越長，抑制率越高；在72 h時不同濃度石榴皮提取物對Caco-2細(xì)胞的增殖抑制率均為最高，其IC50為2.89 g/L。

表1 不同濃度石榴皮提取物對Caco-2細(xì)胞的增殖抑制作用

圖3 石榴皮提取物作用Caco-2細(xì)胞后抑制率與時間關(guān)系

圖4 石榴皮提取物作用Caco-2細(xì)胞后抑制率與濃度關(guān)系

3 討 論

新疆石榴為亞熱帶及溫帶花果木，喜溫暖氣候。新疆石榴主要產(chǎn)于南疆的喀什、和田等地區(qū)，新疆石榴長期生長在高溫、干旱、強(qiáng)光照、沙質(zhì)土壤條件下，其果實(shí)比內(nèi)地大而皮薄、汁多味甜、營養(yǎng)豐富，集食用、藥用和觀賞于一體[1-2]。并有不易裂果、存放時間長的特點(diǎn)。據(jù)粗略統(tǒng)計(jì)，新疆現(xiàn)有石榴種植面積大約2×104km2,石榴產(chǎn)量5×104～6×104噸[3]。主要在和田地區(qū)皮山縣、喀什地區(qū)葉城縣和疏附縣等地[4]。越來越多的體內(nèi)外動物模型都證明了石榴預(yù)防癌癥的作用[5-6]，這些新興的觀點(diǎn)從分子學(xué)角度提出了新的研究方向。

關(guān)于石榴皮的抗腫瘤作用，有研究表明，石榴皮有顯著的抗乳腺癌特性；如果用石榴皮萃取物處理Burkitt淋巴瘤細(xì)胞，其細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化[7]。石榴皮萃取物還可有效地抑制人類子宮肌層成纖維細(xì)胞的增殖[8]。

本研究通過MTT法進(jìn)行體外石榴皮提取物對Caco-2細(xì)胞的生長抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的石榴皮提取物對Caco-2細(xì)胞生長均有抑制作用。本研究只研究了72 h的增殖抑制率影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度石榴皮提取物的增殖抑制率線性不十分明顯，還有待于進(jìn)一步延長作用時間，提高藥物濃度來進(jìn)行研究。關(guān)于石榴皮提取物抑制Caco-2細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，現(xiàn)在研究證明石榴中多酚類物質(zhì)抑制結(jié)腸癌炎癥細(xì)胞信號[9]，據(jù)此推測石榴皮提取物對Caco-2細(xì)胞生長抑制作用可能與這些化學(xué)物質(zhì)有關(guān)，但有待于進(jìn)一步研究證明。

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