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        呼吸道病毒分離培養(yǎng)檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

        2014-03-28 07:35:28蔣荷萍綜述蔣永林審校
        醫(yī)學(xué)綜述 2014年15期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒細(xì)胞系

        蔣荷萍(綜述),蔣永林(審校)

        (宜興市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇 宜興 214221)

        急性呼吸道感染可引起多種臨床疾病,每年造成大量嬰幼兒及兒童的死亡[1],同時也給社會造成了比較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。據(jù)統(tǒng)計,70%~80%的上呼吸道感染是由病毒引起的,至少有7個科、10多類,共239個型別的病毒可引起急性呼吸道感染[3-4]。由于呼吸道病毒所引發(fā)疾病的臨床癥狀比較相近,難以區(qū)分從而進(jìn)行準(zhǔn)確診治。因此,準(zhǔn)確而有效的呼吸道病毒診斷方法對呼吸道疾病的控制至關(guān)重要。傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)法一直被譽(yù)為病毒檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但其一直因耗時長、耗費(fèi)人力且靈敏度差而應(yīng)用越來越少[5]。近年來,傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)也有了很多新的發(fā)展及改進(jìn)。該文就呼吸道相關(guān)的病毒培養(yǎng)發(fā)展進(jìn)行綜述,總結(jié)病毒培養(yǎng)中的新方法。

        1 傳統(tǒng)方法

        自1913年牛痘病毒被首次使用細(xì)胞培養(yǎng)的方法培養(yǎng)出來至今已有100年的歷史,病毒分離培養(yǎng)法一直被譽(yù)為病毒鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”[6]。方法發(fā)展之初,實(shí)驗(yàn)室一般使用自制培養(yǎng)液及長頸瓶或試管,現(xiàn)各樣培養(yǎng)液均已有售。呼吸道病毒培養(yǎng)常用的培養(yǎng)細(xì)胞有人肺癌細(xì)胞(A549)、貂肺上皮細(xì)胞(Mv1Lu)、馬丁達(dá)比犬腎細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)。根據(jù)不同的樣本,不同的病毒培養(yǎng)時間有所不同,一般從數(shù)日到2周不等。經(jīng)典的培養(yǎng)分離鑒定通過觀察細(xì)胞病毒效應(yīng)(cytopathic effect,CPE)來確認(rèn)病毒的生長情況。除個別病毒外,大多數(shù)病毒培養(yǎng)中,CPE的出現(xiàn)一般需要5~10 d,而且不易觀察。因此,呼吸道病毒(如流感病毒,副流感病毒等)多使用血細(xì)胞凝集試驗(yàn)及血凝集抑制試驗(yàn)來進(jìn)行檢測,利用此類病毒在被其感染的細(xì)胞上表達(dá)一種可使紅細(xì)胞凝集的蛋白[7]。有研究發(fā)現(xiàn),在接種甲型與乙型流感病毒12 h后,胎兒肺細(xì)胞會發(fā)生紅細(xì)胞凝集反應(yīng)[8]。CPE與血細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法是目前在病毒培養(yǎng)中最常用的病毒檢測方法。病毒分離培養(yǎng)法可以分離檢測多種病毒,而不像其他方法,一般僅局限于一種病毒的檢測。據(jù)報道,對于呼吸道病毒,呼吸道病毒混合感染的患者占5%~10%[9]。而且雙重感染更易引起嚴(yán)重的呼吸道疾病。所以準(zhǔn)確地診斷所有病毒對疾病的診治十分重要。同時病毒分離培養(yǎng)還可以被用作抗病毒藥物,疫苗的研究,血清分型及流行病學(xué)研究等[10]。不可否認(rèn)的是,傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法繁瑣、費(fèi)時,診斷效率低,因此尋求新的發(fā)展勢在必行[11]。

        2 新方法

        2.1病毒離心培養(yǎng)法及Pre-CPE檢測 病毒離心培養(yǎng)法又稱病毒殼培養(yǎng),是在傳統(tǒng)病毒培養(yǎng)基礎(chǔ)上改進(jìn)的一快速病毒培養(yǎng)方法。此方法是將臨床樣本接種于含有蓋玻片的單層細(xì)胞中,經(jīng)低速離心,以加強(qiáng)病毒對培養(yǎng)細(xì)胞的感染性。但離心可以加強(qiáng)病毒對培養(yǎng)細(xì)胞侵染性的原因還并不明確,起初有學(xué)者認(rèn)為離心可以加劇病毒與單層細(xì)胞的接觸,從而加強(qiáng)侵染,但后來又有研究稱,其原因是離心力對細(xì)胞產(chǎn)生脅迫,促進(jìn)細(xì)胞增殖[12]。由于巨細(xì)胞病毒在10~30 d才能出現(xiàn)CPE現(xiàn)象,最初離心培養(yǎng)法應(yīng)用于巨細(xì)胞病毒[13],之后被廣泛地應(yīng)用于呼吸道病毒,如甲/乙型流感病毒[14-15]、副流感病毒1,2,3型、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒[16]的分離檢測。一般情況下,離心培養(yǎng)法是將樣本加置單層細(xì)胞中,在(600~700)×g下離心1 h,再加入新的培養(yǎng)液,于35~37 ℃下培養(yǎng)。離心培養(yǎng)法也可使用CPE法進(jìn)行檢測,但檢測不僅限于CPE方法。可使用基本抗原抗體反應(yīng)的免疫方法進(jìn)行檢測,不需要一直等到CPE出現(xiàn),可使用酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的單克隆抗體在CPE出體之前進(jìn)行檢測。因?yàn)殡x心培養(yǎng)法中,在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入蓋玻片,檢測時可將蓋玻取出進(jìn)行單克隆抗體染色,為檢測觀察均提供了方便。病毒的離心培養(yǎng)法有以下優(yōu)勢:適用于難以復(fù)制與傳代的病毒,可實(shí)現(xiàn)短期復(fù)制與檢測;比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法耗時短,一般24~48 h內(nèi)可完成檢測;使用Pre-CPE檢測方法相比CPE而言更加客觀。但也有不足之處,使用單克隆抗體法檢測只能檢測到預(yù)想之間的病毒,而預(yù)計之外的病毒無法檢測。

        2.2混合細(xì)胞培養(yǎng)法 混合細(xì)胞培養(yǎng)是將兩種或兩種以上細(xì)胞混合制成混合的單層細(xì)胞,體系中的每種細(xì)胞系均保持在單一細(xì)胞體系中對病毒的敏感性,這樣可使在同一個培養(yǎng)體系中同時培養(yǎng)多種不同的病毒類型。流感病毒的培養(yǎng)一般使用MDCK,引入其他類型的細(xì)胞系可以同時檢測其他常見的呼吸道病毒,這使一次性檢查患者的多種病毒感染成為可能。有研究使用人正常胚胎肺細(xì)胞與A549細(xì)胞同時檢測腺病毒、巨細(xì)胞病毒與單純皰疹病毒,與平行單獨(dú)使用一種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)相比,腺病毒的靈敏度為93.8%,巨細(xì)胞病毒的靈敏度為88.9%,單純皰疹病毒的靈敏度為100%[17]?;旌霞?xì)胞培養(yǎng)多使用Pre-CPE方法進(jìn)行檢測,使用熒光標(biāo)記的多種單克隆抗體,同時檢測多種可能感染病毒。目前,混合細(xì)胞培養(yǎng)已有商業(yè)化產(chǎn)品(Diagnostic Hybrids,Inc.)提供,可供同時檢測多種病毒。R-mix是一項(xiàng)可供培養(yǎng)多種呼吸道病毒的專利混合單層細(xì)胞,包括A549及貂肺上皮細(xì)胞。使用R-mix細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時,同時進(jìn)行3份單層細(xì)胞培養(yǎng),在培養(yǎng)至18~24 h,使用針對于多種不同病毒的單克隆抗體進(jìn)行檢測,若為陽性則進(jìn)行鑒定檢測,若為陰性則在培養(yǎng)48 h后使用單克隆抗體進(jìn)行檢測。大多數(shù)病毒(約98%)在48 h之內(nèi)可以復(fù)蘇,若培養(yǎng)48 h后仍無法用克隆抗體檢測出,則繼續(xù)培養(yǎng)5 d左右,至CPE出現(xiàn)[18]。

        有研究者分別使用直接抗原檢測法、試管傳統(tǒng)培養(yǎng)法及R-mix方法檢測甲型流感病毒,R-mix的靈敏度為96%,試管傳統(tǒng)培養(yǎng)法為85%,直接免疫熒光檢測法為67%[18]。Fader[19]研究表明,使用R-mix檢測甲型流感病毒的靈敏度顯著高于非培養(yǎng)法抗原免疫層析法。Kim等[20]研究223例樣品發(fā)現(xiàn),使用R-mix混合細(xì)胞培養(yǎng)1 d后的陽性率為80%,3 d后為95%,而傳統(tǒng)方法1 d后的陽性率為35%,3 d后為70%。國內(nèi)有使用自行建立的混合細(xì)胞系進(jìn)行病毒培養(yǎng)分離研究,也取得了較好的效果[21-22]。而Barenfanger等[23]發(fā)現(xiàn),使用R-mix方法檢測到陽性的時間平均為1.4 d,而使用傳統(tǒng)試劑管培養(yǎng)法檢測到陽性的平均時間是5.2 d。R-mix細(xì)胞可以培養(yǎng)比較難以分離的病毒,如SARS冠狀病毒[24]。由于SARS冠狀病毒有高危性,為了減少可能培養(yǎng)出SARS冠狀病毒的風(fēng)險,可使用R-mix Too細(xì)胞系,其為MDCK細(xì)胞與A459細(xì)胞的混合細(xì)胞系,對呼吸道病毒敏感,但不能培養(yǎng)SARS冠狀病毒。R-mix與R-mix Too細(xì)胞系為常見呼吸道病毒的分離培養(yǎng)提供了簡便可行的方法,這使病毒培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室無需儲存準(zhǔn)備多種細(xì)胞系,可供傳統(tǒng)培養(yǎng)、離心培養(yǎng)、Pre-CPE檢測使用。

        2.3使用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng) 為了同時增進(jìn)檢測的準(zhǔn)確性與檢測速度,轉(zhuǎn)基因細(xì)胞被應(yīng)用到病毒培養(yǎng)中。其技術(shù)原理是將某種特定的基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞,當(dāng)某種特定的病毒侵入細(xì)胞時,會促發(fā)某種機(jī)制,導(dǎo)致產(chǎn)生一種易于測定的酶。這些特定的基因一般由病毒、細(xì)菌或一些細(xì)胞資源中獲得,這些一般被稱作病毒報告基因。這種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞有一個啟動子,在未被病毒侵染時,其是沉默的,可以被特定的病毒反式激活蛋白激活,但不能被其他病毒激活。早在1980年,就有報道研究有關(guān)人類免疫缺陷病毒1型病毒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系研究,但研究存在一些缺陷,沒能成功應(yīng)用[25]。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的首次成功應(yīng)用是用鼠L-細(xì)胞培養(yǎng)鑒定脊髓灰質(zhì)炎病毒[26]。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞比較廣泛地應(yīng)用于單純皰疹病毒、腸病毒。應(yīng)用于呼吸道病毒是使用人腎胚293T細(xì)胞,通過非翻譯區(qū)的流感病毒A/WSN/33型的核蛋白來表達(dá)RNA轉(zhuǎn)錄編碼的綠色熒光蛋白與螢火蟲蛋白。報告基因活性于流感病毒感染6 h后激活后進(jìn)行表達(dá),通過化學(xué)發(fā)光法來檢測熒光素酶。因?yàn)榇讼到y(tǒng)需要病毒侵染的細(xì)胞才能檢測到陽性,不像其他檢測系統(tǒng)可檢測到感染與非感染的病毒,所以其特異性更強(qiáng)。例如分子檢測方法可以檢測到感染與未感染的病毒,但此種檢測方法對未預(yù)計的病毒同樣難以檢測。

        3 小 結(jié)

        隨著世界醫(yī)學(xué)水平的快速發(fā)展,病毒檢測的方法越來越多,核酸檢測技術(shù)、免疫學(xué)方法檢測技術(shù)等各項(xiàng)技術(shù)層出不窮。尤其是聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法,憑借其操作簡便、靈敏度高的優(yōu)勢得到了廣泛的應(yīng)用。而病毒分離培養(yǎng)法雖一直被稱為是病毒鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但存在靈敏度低、耗時耗力等弊端。隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)技術(shù)也出現(xiàn)了多種新的進(jìn)步,提高了該方法的實(shí)用性。近年來,其他各種病毒檢測方法已經(jīng)朝著自動化程度高的方向發(fā)展,因此病毒培養(yǎng)法也必將朝著自動、廉價、快捷的方向前行。

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