胡楠楠，王雪峰，岳志軍，南春紅，朱萬青，暴春曉

流感一詞來源于拉丁語“influentia”的意大利語形式，意為“流行的、傳染的”，2009-04以來，由H1N1引發(fā)的甲型流感病毒在世界范圍內(nèi)的流行引起了廣泛的關(guān)注，并好發(fā)于兒童和老人，本研究基于此，通過甲型流感病毒FM1株誘導(dǎo)不同鼠齡肺炎，評(píng)價(jià)哪一鼠齡昆明種小鼠為甲型流感病毒理想模型。

1 材料與方法

1.1 病毒 甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/FM1/47(H1N1 influenza virus,IV)，由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院病毒研究所提供，凍存于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)病毒室。解凍后經(jīng)9日齡尼克白種雞胚(SPF級(jí)，購(gòu)買于遼寧益康生物制品廠)的尿囊腔接種培養(yǎng)傳代后為FM1M9E2M1E3M2E4M1E5。微量血凝實(shí)驗(yàn)滴定效價(jià)，血凝效價(jià)1∶1 280者供實(shí)驗(yàn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.2.1 用于甲型流感病毒對(duì)幼齡小鼠LD50測(cè)定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種幼齡小白鼠30只，清潔級(jí)，雌雄各半，3～4周齡，體質(zhì)量12～14 g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠置于無病原體清潔籠內(nèi)飼養(yǎng)，飼料和飲用水經(jīng)高溫高壓消毒。

1.2.2 用于模型觀察的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小白鼠150只，清潔級(jí)，雌雄各半，鼠齡均等，幼齡鼠選3～4周齡，體質(zhì)量(12±2)g，成齡鼠選3月齡，體質(zhì)量(30±5)g，老齡鼠選用20月齡，體質(zhì)量(30±5)g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠置于無病原體清潔籠內(nèi)飼養(yǎng)，飼料和飲用水經(jīng)高溫高壓消毒。

1.3 主要儀器與試劑 BX50F4型系統(tǒng)生物顯微鏡(日本OLYPUS)；RM2135型精密轉(zhuǎn)輪切片機(jī)(德國(guó)LEICA)；EG1150型石蠟包埋機(jī)(Leica)；LC-11型熒光定量PCR儀(ROCHE)；C232NWI型超低溫冰箱(意大利indesit)；甲型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，批號(hào)：2011004)；核酸提取試劑(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，批號(hào)：20110603)；引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，GAPDH:上游5'-GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG-3'，下游5＇-TGG AAA TTG TGA GGG AGA TGC-3',擴(kuò)增特異片段長(zhǎng)度為336 bp。IV:上游5'-GAG AAA GAA GTC CTT GTG C-3'，下游5＇-TCT ATC ATT CCA GTC CAT CCC-3',擴(kuò)增特異片段長(zhǎng)度為530 bp。

1.4 方法 將IV增毒后的新鮮尿囊液(血凝滴度1∶1 280)10倍系列稀釋6個(gè)濃度(1×10-1～1×10-6)，將30只幼齡昆明種小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分6組，每組5只。在乙醚麻醉下經(jīng)鼻腔接種甲型流感病毒FM1株，每組接種同一個(gè)濃度(0.05 mL/只)；連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠死亡情況，并進(jìn)行死亡百分率統(tǒng)計(jì)，計(jì)算IV小鼠半數(shù)致死量(LD50)。另選取150只不同鼠齡昆明種小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：幼齡模型組40只，成齡模型組40只，老齡模型組40只，幼齡正常組、成齡正常組、老齡正常組各10只。依照文獻(xiàn)[1]用無水乙醚麻醉小鼠，每鼻孔15 LD50滴鼻IV液0.05 mL。不同鼠齡正常對(duì)照組在同等條件下接種等量不含病毒的生理鹽水。

各組模型分別于造模后第3、5、7天，按隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只，麻醉后頸椎脫臼處死取材。無菌開胸，取出整個(gè)肺臟稱肺質(zhì)量計(jì)算肺濕質(zhì)量，并計(jì)算濕質(zhì)量肺指數(shù)(肺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)。后取左肺，4%多聚甲醛固定待做病理切片檢查。根據(jù)文獻(xiàn)[1]方法，對(duì)小鼠病毒性肺炎組織病理學(xué)進(jìn)行評(píng)分。取右肺組織無菌處理，進(jìn)行甲型流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)。

1.5 熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測(cè)模型各組小鼠肺組織IV總RNA 采用離心柱法提取IV病毒核酸和PCR擴(kuò)增，取50 mg鼠肺組織，加入200 μL生理鹽水，加入200 μL的裂解工作液，標(biāo)準(zhǔn)操作，離心使用低溫離心機(jī)，溫育溫度控制在72 ℃，得到病毒核酸溶液。取適量PCR反應(yīng)管，每管加入IVA PCR反應(yīng)液，于對(duì)應(yīng)PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的陰性質(zhì)控品、待檢測(cè)標(biāo)本核酸、IVA強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、IVA臨界陽(yáng)性質(zhì)控品各5 μL，8 000 r/min。擴(kuò)增參數(shù)：50 ℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 15 s，2個(gè)循環(huán)；58 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；40 ℃ 10 s，1個(gè)循環(huán)，結(jié)束后自動(dòng)分析。

1.6 觀察指標(biāo) 動(dòng)態(tài)觀察小鼠生命狀態(tài)：每天觀察記錄各組小鼠、皮毛色澤、飲食、活動(dòng)情況和精神狀態(tài)，定期測(cè)量體質(zhì)量。分別于感染3、5、7 d，檢測(cè)其肺濕質(zhì)量、肺組織肉眼病理評(píng)分、肺組織病理切片以及肺組織FQ-PCR病毒載量檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 甲型IV株對(duì)幼齡小鼠LD50的測(cè)定 見表1。

表1 幼齡小鼠接種不同濃度IV后的死亡情況(n)

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠一般狀態(tài)觀察 幼齡模型組死亡最多，其中接毒24 h內(nèi)死亡2只，14 d內(nèi)共死亡15只，在第5天達(dá)到死亡高峰，與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。成齡模型組14 d內(nèi)共死亡2只，其余小鼠表現(xiàn)活潑，反應(yīng)靈敏，呼吸平穩(wěn)，毛色光潔，鼻腔未見明顯分泌物，無呼吸系統(tǒng)疾病的癥狀表現(xiàn)。老齡模型組14 d內(nèi)死亡5只，解剖后觀察肺組織炎癥提示2只有輕度炎癥，其他3只肺組織無改變。

2.3 不同時(shí)點(diǎn)各組小鼠肺指數(shù)評(píng)分與肺組織病理評(píng)分比較 見表2。

表2 不同時(shí)點(diǎn)各組小鼠肺指數(shù)比較±s，n=10)

表2結(jié)果表明，各年齡正常對(duì)照組小鼠在不同時(shí)點(diǎn)肺指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。幼齡模型組肺指數(shù)最高，與幼齡正常對(duì)照組、成齡模型組及老齡模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，感染第5天肺指數(shù)達(dá)到最高。

不同時(shí)點(diǎn)取小鼠肺組織(3組正常對(duì)照各取2只觀察肺組織)，觀察其外觀病變程度。結(jié)果顯示：各對(duì)照組小鼠在不同時(shí)點(diǎn)肺組織外觀全肺野無病變，見圖1(封三)；幼齡模型組肺組織病變最重，成齡模型組各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與幼齡模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與老齡模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；老齡模型組各時(shí)間點(diǎn)與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，老齡模型組第5天肺組織病變有恢復(fù)的趨勢(shì)。

2.4 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織病理改變 光鏡下觀察幼齡模型組：病變區(qū)內(nèi)肺泡間隔明顯增寬，血管擴(kuò)張、充血，間質(zhì)水腫伴大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；氣管管壁及其周圍間質(zhì)充血、水腫，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)可見滲出液；符合肺炎病理表現(xiàn)，見圖2～4(封三)。成齡模型組：氣管管壁無充血、水腫，肺泡間隔無增寬，血管無擴(kuò)張、充血，未見明顯的炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。老齡模型組：造模后第5天氣管管壁有充血、水腫，未見明顯的炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。

2.5 各組小鼠肺組織不同時(shí)點(diǎn)小鼠肺組織FQ-PCR 見表3。

表3 各組小鼠肺組織不同時(shí)點(diǎn)小鼠肺組織FQ-±s，n=10)

表3結(jié)果表明，幼齡模型組病毒載量最多，第7天肺組織IV病毒載量達(dá)到高峰，病毒載量呈遞增趨勢(shì)，各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；成齡鼠模型組在滴鼻接種第3天病毒載量最少，雖然在第5天有明顯增高趨勢(shì)，但第7天依然維持在第5天水平，第5、7天相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。老齡鼠模型組在第3天時(shí)病毒載量最高，第5天明顯升高，但第5、7天相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

選擇復(fù)制人類感染流感病毒的動(dòng)物模型，首先是要所復(fù)制的模型應(yīng)盡可能的類似于人類感染流感病毒后的狀況，設(shè)計(jì)動(dòng)物模型時(shí)要遵循以下原則：相似性、重復(fù)性、可靠性、適用性和經(jīng)濟(jì)性[2]。小鼠模型能夠進(jìn)行防治流感病毒感染、藥物免疫作用等方面的研究[3-5]。由于小鼠和人的親緣關(guān)系較近，遺傳學(xué)背景清楚，有其價(jià)廉、實(shí)驗(yàn)周期短、易于飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，許多疾病可以為此動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)研究。

本研究依照文獻(xiàn)[1，3]的方法,以IV鼠肺適應(yīng)株滴鼻建立小鼠肺炎模型。通過滴鼻接種幼齡、成齡與老齡昆明種小鼠建立IV肺炎動(dòng)物模型的對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究，觀察小鼠一般狀態(tài)及存活只數(shù)，比較各組小鼠的不同時(shí)點(diǎn)肺指數(shù)與肺組織病理評(píng)分，測(cè)定小鼠肺組織中不同時(shí)點(diǎn)肺組織FQ-PCR。

結(jié)果顯示，幼齡昆明種小鼠對(duì)甲型流感病毒FM1株更具有易感性，為甲型流感病毒FM1感染模型的最佳受試體，雖然結(jié)果中，老齡昆明種小鼠在接種后第3天也顯示出了肺組織的病變，但是其組織中的流感病毒含量較少與幼齡鼠肺組織中的流感病毒含量有顯著差異。故而以甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株滴鼻建立小鼠肺炎模型，幼齡模型組流感病毒感染模型造模成功，成齡鼠、老齡鼠不能成功造模。該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果確證了幼齡昆明種小鼠對(duì)流感病毒的易感性，是甲型流感病毒FM1株誘導(dǎo)小鼠急性肺炎的理想模型。

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(收稿日期：2014-04-03)