黃莉?qū)?薛汝增 羅光浦 陳勇軍 曲永彬 吳鐵強(qiáng) 林爾藝 陳永鋒

·短篇論著·

p－Akt、p－FoxO1在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)

黃莉?qū)?薛汝增 羅光浦 陳勇軍 曲永彬 吳鐵強(qiáng) 林爾藝 陳永鋒?

目的: 檢測p－Akt和p－FoxO1蛋白在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)。方法: 收集30例尋常型銀屑病患者的皮損及30名健康對照皮膚組織,采用Western blot法檢測p－Akt和p－FoxO1的表達(dá)。結(jié)果: 與正常皮膚組相比,尋常型銀屑病皮損中p－Akt和p－FoxO1的表達(dá)水平明顯上調(diào),兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。結(jié)論: Akt和FoxO1可能與銀屑病皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖有關(guān)。

尋常型銀屑病； FoxO1； Akt； 蛋白印跡法

尋常型銀屑病是一種紅斑鱗屑性疾病,其發(fā)病率高、難治愈、易復(fù)發(fā),嚴(yán)重影響患者的身心健康。目前認(rèn)為本病是遺傳因素與環(huán)境因素等多種因素相互作用的多基因遺傳病,通過免疫介導(dǎo)的共同信號(hào)通路引起角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖。1組織病理具有角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和真皮乳頭血管新生且迂曲擴(kuò)張等特點(diǎn)。2目前引起角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖的機(jī)制尚未闡明。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase, PI3K)/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞存活的重要通路,參與細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖等多個(gè)過程。FoxO1作為其下游的效應(yīng)靶蛋白,在細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖中亦發(fā)揮重要作用。本研究對尋常型銀屑病皮損中Akt及其下游效應(yīng)靶蛋白FoxO1的磷酸化水平進(jìn)行檢測,探討其在銀屑病發(fā)病過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集本院2012年門診和住院的尋常型銀屑病患者30例,其中男15例、女15例,年齡16～54歲,平均36.2歲,病史0.5個(gè)月至27年,所有病例均具有典型皮損并經(jīng)組織病理診斷,本次發(fā)病以來均未經(jīng)任何治療。健康對照組30例,來自我院皮膚外科手術(shù)多余的正常皮膚或手術(shù)環(huán)切的包皮。取材后,將標(biāo)本立即置于液氮中冷凍保存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過并與患者簽署知情同意書。

1.2 試劑 p－Akt1/2/3(Ser473)、β－actin多克隆抗體均購于美國Santa Cruz公司,p－FoxO1(S256)多克隆抗體購于美國Abcom公司,AP標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司,10%SDS－PAGE預(yù)制膠購于上海生工生物工程公司,聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購于美國PALL公司,BCA法蛋白定量試劑盒、RIPA蛋白裂解液、ECL顯色試劑盒、Tris－甘氨酸電泳緩沖液、半干轉(zhuǎn)膜液及其它試劑購于江蘇碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 Western blot檢測 從液氮中取出凍存的標(biāo)本,用眼科剪將組織剪切成細(xì)小的碎片并用組織勻漿器勻漿,RIPA細(xì)胞裂解液(內(nèi)含PMSF)冰上裂解細(xì)胞, BCA法測定蛋白濃度,取50 μg總蛋白變性后進(jìn)行SDS－PAGE恒壓電泳,半干法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉4℃封閉2 h,滴加一抗(1∶1000),4℃過夜,TBST洗膜4次,每次10 min,滴加二抗(1∶5000),37℃孵育2 h,TBST洗膜4次,每次10 min,按ECL試劑盒說明進(jìn)行顯色,在自動(dòng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)下自動(dòng)成像,分析目的蛋白條帶的平均灰度值,以β－actin蛋白作為內(nèi)參,以目的蛋白與β－actin的灰度比值作為目的蛋白的相對含量,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每兩組相對灰度值之間的比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

尋常型銀屑病皮損中p－Akt及p－FoxO1的相對灰度值為1.02±0.27和1.83±0.61,與健康對照組0.55 ±0.09和0.69±0.12相比,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t＝5.41,P＜0.05)。結(jié)果見圖1、2。

圖1 兩組灰度值電泳圖

圖2 兩組灰度值比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),尋常型銀屑病皮損組織中角質(zhì)形成細(xì)胞的增生速度是正常表皮的2倍,而其細(xì)胞周期縮短了8倍(36 h比311 h),每日生成的角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)量高出正常表皮的28倍。3角質(zhì)形成細(xì)胞良性過度增殖是尋常型銀屑病的病理特征之一,而對其過度增殖的機(jī)制目前仍未完全闡明。李政霄等4發(fā)現(xiàn)上皮鈣黏素和β連環(huán)蛋白表達(dá)下調(diào)可能與銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞高度增殖有關(guān)；劉厚君等5發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白A、D1、B1和E可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖參與了銀屑病的發(fā)病。但這些研究僅局限于下游效應(yīng)分子的表達(dá),對于上游信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控未闡明。為此,本研究將PI3K/Akt信號(hào)通路及下游FoxO1蛋白作為研究靶點(diǎn),進(jìn)一步闡明其可能的發(fā)病機(jī)制。

PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一條調(diào)控細(xì)胞增殖的重要通路,Akt是PI3K下游直接的靶蛋白,屬于一種癌基因,因其與蛋白激酶A和C有高度同源性,又被命名為蛋白激酶B(簡稱PKB)。6Akt是PI3K信號(hào)通路關(guān)鍵的分子,通過磷酸化其下游糖原合成酶激酶－3、Bad(Bcl－2家族成員)、FoxO家族等蛋白來調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡。7,8本研究發(fā)現(xiàn),銀屑病皮損中p－ Akt的表達(dá)水平明顯上調(diào),這與張曉艷等9的研究結(jié)果一致。既往研究銀屑病中PI3K/Akt信號(hào)下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路局限于Bad及mROT,形成PI3K/Akt/mROT通路,10而對于Fox蛋白家族的表達(dá)情況,研究較少。

Fox蛋白(forkhead box)是脊椎動(dòng)物叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子的總稱,2000年正式統(tǒng)一命名,是一個(gè)具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子大家族,通常和細(xì)胞生長發(fā)育的調(diào)控有關(guān)。11該家族的共同特征是具有一個(gè)長110個(gè)氨基酸的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,稱為Fox結(jié)構(gòu)域,折疊成3個(gè)α螺旋和2個(gè)翅膀狀(winged)的大環(huán)結(jié)構(gòu)。至今已經(jīng)定義了17類Fox蛋白,即FoxA～Q,目前研究最多的是FoxO亞家族。12FoxO在進(jìn)化上高度保守,氨基酸序列中含有3個(gè)Akt磷酸化基序,是胰島素/胰島素樣生長因子信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子,其上游受PI3K/Akt磷酸化級聯(lián)通路的調(diào)節(jié),下游靶基因則與細(xì)胞增殖、分化、代謝、凋亡及基因表達(dá)密切相關(guān)。13FoxO1作為FoxO家族的重要亞成員之一,主要在脂肪組織高表達(dá),在生長因子或胰島素刺激下,通過Akt依賴的Thr32、Ser253和Ser315三個(gè)特殊位點(diǎn)的磷酸化而受到調(diào)控。這種Akt依賴的磷酸化發(fā)生后,改變FoxO1蛋白的亞細(xì)胞定位,使其從細(xì)胞核向胞漿轉(zhuǎn)移,失去轉(zhuǎn)錄因子的活性,減少其下游靶基因的合成,從而失去對細(xì)胞增殖的抑制,導(dǎo)致細(xì)胞的過度增殖。

由此推測,銀屑病皮損內(nèi)的炎癥因子激活PI3K,進(jìn)一步活化Akt,磷酸化的Akt導(dǎo)致下游的FoxO1磷酸化水平升高,使其從細(xì)胞核向胞漿轉(zhuǎn)移,失去轉(zhuǎn)錄因子的活性,導(dǎo)致下游效應(yīng)分子的表達(dá)異常,使得角質(zhì)形成細(xì)胞出現(xiàn)過度增殖。本研究結(jié)果顯示尋常型銀屑病皮損中Akt、FoxO1的磷酸化水平增高,證實(shí)了該推論。

1張學(xué)軍.皮膚性病學(xué).7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008.141－144.

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4李政霄,紀(jì)泛撲,彭振輝,等.上皮鈣粘素、β－連環(huán)蛋白、細(xì)胞周期素D1在進(jìn)行期尋常型銀屑病皮損的表達(dá).南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(4):545－547.

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(收稿:2014－04－05 修回:2014－05－27)

The expressions of p－Akt and p－FoxO1 in the lesions of psoriasis vulgaris

HUANG Li-ning,XUE Ru-zeng,LUO Guang-pu,et al.Guangdong Provincial Dermatology Hospital,Guangzhou,510091

Objective:To detect the expression of p－Akt and p－FoxO1 in the lesions of psoriasis vulgaris. Methods:The levels of p－Akt and p－FoxO1 were detected by Western Blot in the lesions from 30 patients with psoriasis vulgaris and normal skin specimens from 30 healthy controls.Results:Compared with the controls,the expressions of p－Akt and p－FoxO1 were significantly up－regulated in psoriasis vulgaris lesions(P＜0.05).Conclusion:p－Akt and p－FoxO1 may contribute to the abnormal proliferation of keratinocytes in the lesions of psoriasis vulgaris.

psoriasis vulgaris；FoxO1；Akt；Western blot

廣東省皮膚病醫(yī)院,廣東廣州,510091

?通信作者