孫 炯，楊留才,李仕紅,徐紅濤

(1.亭湖區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,江蘇 鹽城224000； 2.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術學院,江蘇 鹽城 224006)

子宮內膜癌是女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。研究表明，與增殖、凋亡相關的細胞因子表達異常可導致細胞周期發(fā)生紊亂，細胞無限制生長，最終導致惡性腫瘤的發(fā)生[1]。生存蛋白(Livin)是凋亡抑制蛋白家族成員，研究表明其在乳腺癌[2]、食管癌等實體腫瘤和腫瘤細胞系中表達水平顯著增高[3]。而胱天蛋白酶(caspase)-3是caspase家族的成員之一，其主要的功能為被凋亡通路激活，導致細胞凋亡[4]。本研究通過免疫組織化學染色法檢測Livin與caspase-3在子宮內膜癌組織中的表達情況及其相關性，并探討兩者在子宮內膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2009年6月至2011年6月于亭湖區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科就診且進行活檢或手術治療的患者268例，年齡36～69(46.3±10.1)其中子宮內膜癌196例作為試驗組，取子宮內膜癌患者肌瘤旁正常組織72例作為對照組。試驗組患者年齡<45歲者90例、≥45歲者106例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟臨床分期：Ⅰ期67例、Ⅱ期55例、Ⅲ期42例、Ⅳ期32例；病理診斷：高分化72例、中分化76例、低分化48例；有淋巴結轉移82例、無淋巴結轉移114例。所有患者在進行手術前未經(jīng)過放療和化療等治療措施。

1.2方法 石蠟切片脫蠟水化，加羊抗人Livin一抗(1∶100,美國Santa Cruz 公司)，羊抗人caspase-3一抗(1∶200,美國Santa Cruz 公司)兔抗羊IgG二抗(1∶100，美國Sigma公司)室溫孵育40 min；磷酸鹽緩沖液清洗，加Elite-AP(美國Vector公司，)孵育30 min，磷酸鹽緩沖液清洗，二氨基聯(lián)苯胺底物液(中國邁新公司)顯色5 min，蘇木精復染10 s，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察攝片。

1.3染色結果判斷 染色結果顯示Livin和caspase-3均定位于胞質中，以胞質內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞標志。在高倍鏡下隨機選取10個視野，根據(jù)陽性細胞在全部組織細胞中所占比例判定實驗結果，陽性細胞數(shù)占全部組織細胞數(shù)比例<10%判斷為(-)，陽性細胞數(shù)占全部組織細胞數(shù)比例為10%～50%判斷為(+)，陽性細胞數(shù)占全部組織細胞數(shù)>50%判斷為(++)，以(+)及(++)作為顯色陽性[5]。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗，相關性分析采用Spearman檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1兩組Livin和caspase-3表達情況的比較 試驗組 Livin表達的陽性率顯著高于對照組(77.04% vs 11.11%)；試驗組caspase-3表達的陽性率顯著低于對照組(28.06% vs 73.61%),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

對照組：子宮內膜癌患者肌瘤旁正常組織；試驗組：子宮內膜癌

2.2子宮內膜癌組織中Livin和caspase-3表達與臨床、病理指標的關系 臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期患者的Livin陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期，而caspase-3陽性表達率低于Ⅰ～Ⅱ期，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高分化患者Livin陽性表達率低于中、低分化患者，而caspase-3陽性表達率高于中、低分化患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；有淋巴結轉移的患者Livin陽性表達率高于無淋巴結轉移患者，而caspase-3陽性表達率低于無淋巴結轉移患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。

2.3子宮內膜癌組織中Livin和caspase-3表達的相關性 在子宮內膜癌組織中，Livin檢出陽性率高于caspase-3(χ2=57.600，P=0.000)。Spearman等級檢驗結果顯示：Livin和caspase-3表達在子宮內膜癌組織中呈負相關(rs=-0.56,P<0.05)(表3)。

表2 子宮內膜癌組織中Livin和caspase-3表達與臨床、病理指標的關系

對照組：子宮內膜癌患者肌瘤旁正常組織 試驗組：子宮內膜癌；a與高分化比較，P<0.05

表3 子宮內膜癌組織中Livin和caspase-3表達的相關性 (例)

3 討 論

現(xiàn)有的研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細胞增殖、凋亡的平衡紊亂存在密切關系。細胞凋亡是由基因控制的自殺程序引起的主動性死亡[6]，其中Survivin[7]、p53[8]、Bcl-2[9]和caspases[10]等細胞因子在腫瘤的發(fā)生過程中起到了重要作用。

本研究結果顯示,Livin在正常組織中陽性表達率低于子宮內膜癌陽性表達率,Livin的蛋白表達水平越高，子宮內膜癌的臨床分期越晚，病理分級越低，淋巴結轉移的可能性越大，表明Livin在腫瘤組織中的表達水平越高，患者的預后相對越差。Gazzaniga等[11]的研究結果表明，膀胱癌患者中Livin表達陽性的復發(fā)時間顯著短于Livin陰性表達，說明Livin的表達水平與預后存在密切關系。周莉等[12]的研究結果也發(fā)現(xiàn)，Livin不僅在子宮內膜癌中高表達，并且可能與子宮內膜癌的預后相關，這與本研究的結果基本一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，caspase-3在子宮內膜癌組織中的陽性率較正常組織低，并且caspase-3在子宮內膜癌組織中表達水平越低，分化越差，臨床分期越晚，患者的預后越差。本研究結果與在乳腺癌[13]、卵巢癌[14]等實體腫瘤中的研究結果基本一致。caspase是一組存在于胞質中的半胱氨酸蛋白酶，目前的研究認為caspase-3是整個凋亡過程中最重要的執(zhí)行者之一，能夠水解大量底物蛋白[15]。同時caspase-3也是線粒體和死亡受體兩條凋亡信號途徑的共同通道，凋亡通路一旦激活則引起caspase-3級聯(lián)反應并使其活化引起細胞凋亡，體外實驗表明，經(jīng)過地塞米松處理的子宮內膜癌發(fā)生凋亡，并且與細胞內caspase-3水平上調有關[16]。而范引俠等[1]的研究結果也發(fā)現(xiàn),子宮內膜癌組織中的caspase-3水平顯著下調。上述研究結果與本研究結果基本一致，說明在子宮內膜癌中caspase-3的表達水平顯著下調，導致細胞增殖和凋亡間的平衡被打破，細胞凋亡減少，增殖增加。

本研究結果還顯示，Livin與caspase-3在子宮內膜癌中的表達呈負相關，說明Livin可能通過影響caspase-3的表達水平來調控細胞的凋亡。目前研究認為其作用機制主要表現(xiàn)為以下兩個方面：①Livin能直接下調caspase-3的表達水平，減少凋亡的發(fā)生；②Livin通過與caspase-9結合，并且降低caspase-3的表達水平抑制線粒體信號通路發(fā)生抑制凋亡[17]。

綜上所述，Livin在子宮內膜癌的組織中高表達，caspase-3在子宮內膜癌的組織中低表達，且兩者的表達水平均與臨床分期、病理分級以及淋巴結轉移相關；Livin和caspase-3表達在子宮內膜癌組織中呈負相關，提示Livin可能通過與caspase-3共同作用促進子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展。

[1] 范引俠,薛翔,主改俠.凋亡調控因子Survivin和Caspase-3在子宮內膜癌中的表達及意義[J].西安交通大學學報：醫(yī)學版,2007,28(1):93-96.

[2] Liang CY,Ma P,Liu XL.RNAi-mediated gene silencing of livin synergistic with epirubicin enhance apoptosis of human breast cancer cells[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2008,88(24):1703-1706.

[3] Chen L,Ren GS,Li F,etal.Expression of livin and vascular endothelial growth factor in different clinical stages of human esophageal carcinoma[J].World J Gastroenterol,2008,14(37):5749-5754.

[4] Tong J,Xie G,He J,etal.Synergistic antitumor effect of dichloroacetate in combination with 5-fluorouracil in colorectal cancer[J].J Biomed Biotechnol,2011,2011:740564.

[5] Gok M,Rozendaal L,Berkhof J,etal.Cytology history preceding cervical cancer diagnosis:a regional analysis of 286 cases[J].Br J Cancer,2011,104(4):685-692.

[6] O′Neal P,Alamdari N,Smith I,etal.Experimental hyperthyroidism in rats increases the expression of the ubiquitin ligases atrogin-1 and MuRF1 and stimulates multiple proteolytic pathways in skeletal muscle[J].J Cell Biochem,2009,108(4):963-973.

[7] Chan KS,Wong CH,Huang YF,etal.Survivin withdrawal by nuclear export failure as a physiological switch to commit cells to apoptosis[J].Cell Death Dis,2010,1:e57.

[8] Qiu W,Wu B,Wang X,etal.PUMA-mediated intestinal epithelial apoptosis contributes to ulcerative colitis in humans and mice[J].J Clin Invest,2011,121(5):1722-1732.

[9] Onori P,DeMorrow S,Gaudio E,etal.Caffeic acid phenethyl ester decreases cholangiocarcinoma growth by inhibition of NF-kappaB and induction of apoptosis[J].Int J Cancer,2009,125(3):565-576.

[10] Han Y,Gao L,Sun N,etal.Effects of Kang-Jia-Wan,a Chinese medicinal herb officinal,on apoptosis induction in goiter of rats[J].J Ethnopharmacol,2009,122(3):533-540.

[11] Gazzaniga P,Gradilone A,Giuliani L,etal.Expression and prognostic significance of LIVIN,SURVIVIN and other apoptosis-related genes in the progression of superficial bladder cancer[J].Ann Oncol,2003,14(1):85-90.

[12] 周莉,郭兵.Livin在子宮內膜癌中的表達及意義[J].中國婦幼健康研究,2010,21(3):324-326.

[13] Scarlatti F,Maffei R,Beau I,etal.Role of non-canonical Beclin 1-independent autophagy in cell death induced by resveratrol in human breast cancer cells[J].Cell Death Differ,2008,15(8):1318-1329.

[14] Kumar S,Bryant CS,Chamala S,etal.Ritonavir blocks AKT signaling,activates apoptosis and inhibits migration and invasion in ovarian cancer cells[J].Mol Cancer,2009,8:26.

[15] Chougule MB,Patel AR,Jackson T,etal.Antitumor activity of Noscapine in combination with Doxorubicin in triple negative breast cancer[J].PLoS One,2011,6(3):e17733.

[16] 崔琳,朱丹梅.CASPASE-3與子宮內膜癌細胞(HEC-1B)凋亡的研究[J].中國社區(qū)醫(yī)師：醫(yī)學專業(yè),2011,13(10):274-275.

[17] Yang D,Song X,Zhang J,etal.Suppression of livin gene expression by siRNA leads to growth inhibition and apoptosis induction in human bladder cancer T24 cells[J].Biosci Biotechnol Biochem,2010,74(5):1039-1044.