廖占玲，王炳銀，劉 峰

(上海交通大學醫(yī)學院蘇州九龍醫(yī)院心臟中心，江蘇 蘇州 215021)

傳統(tǒng)的觀念一直認為心臟是一個終末分化器官，心肌細胞不能再生，肥大是其唯一的表現(xiàn)形式。然而，近年的多項研究發(fā)現(xiàn)新生兒及成人心臟的心肌細胞具有有絲分裂能力[1-2]。心肌細胞增殖再生現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，無疑讓再生醫(yī)學成為當前心血管領(lǐng)域研究的熱點之一，目前有關(guān)心肌細胞再生研究尚處于初級階段，進一步明確心肌缺血損傷后心肌細胞增殖能力是研究的重點。本實驗以大鼠為研究對象，采用經(jīng)口氣管插管后開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法制作急性心肌梗死模型[3]，應(yīng)用5-溴-2-脫氧尿苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，Brdu)標記法及免疫組織化學法觀察研究急性心肌梗死后心肌細胞增殖的情況，從而為進一步改進心肌梗死治療方法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取蘇州大學動物實驗中心SPF級雄性SD大鼠14只，2～3月齡，體質(zhì)量為250～300 g，按隨機數(shù)字表法分兩組：實驗組9只，對照組5只。普通飼料喂養(yǎng)，自由攝食水。

1.2方法與試劑

1.2.1急性心肌梗死模型的建立 3%戊巴比妥(Sigma 美國)25 mg/kg與氯胺酮(福建古田藥業(yè))50 mg/kg腹腔注射，輔以皮下注射阿托品(徐州萊恩藥業(yè))0.2 mg/kg聯(lián)合麻醉。呼吸機輔助呼吸，左前外側(cè)第4肋間切口開胸，在動脈圓錐與左心耳之間距主動脈根部2～3 mm處用5-0絲線結(jié)扎左冠狀動脈。觀察數(shù)分鐘后，見前壁心肌變蒼白、局部室壁運動減低及胸前導聯(lián)ST段弓背向上抬高后逐層關(guān)胸。待大鼠恢復自主呼吸后，拔出氣管內(nèi)插管，喂養(yǎng)觀察。對照組采用開胸置縫線而不結(jié)扎，余步驟均相同。

1.2.2注射Brdu作標記 各組大鼠于處死前12 h和24 h分別行腹腔注射Brdu(Sigma 美國)，50 mg/kg。

1.2.3標本采集及處理 于術(shù)后第10日處死大鼠，取出心臟，采集左心室梗死邊緣區(qū)和右心室非梗死區(qū)的心肌標本，石蠟包埋，連續(xù)切5 μm厚的石蠟片，用于蘇木精-伊紅染色觀察心肌病理變化及免疫組織化學法檢測。

1.2.4免疫組織化學法檢測Brdu 采用卵白素-生物素-過氧化物酶復合物免疫組織化學法，即ABC法檢測大鼠心肌組織Brdu陽性細胞。步驟：切片置于68 ℃烤箱中45 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；抗原修復；3% H2O2孵育20 min；1.5%山羊血清封閉60 min；一抗工作液(cell signaling公司，1∶400)4 ℃過夜(并用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照)；二抗37 ℃孵育60 min；辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液(santa cruz公司)37 ℃孵育30 min；室溫下3-二氨基聯(lián)苯氨顯色，鏡下控制顯色時間；蘇木精核復染、脫水透明、封片后鏡檢。

1.2.5心肌細胞Brdu陽性率 在顯微鏡400倍視野下，每個切片隨機選取10個視野，計數(shù)心肌細胞總數(shù)和Brdu陽性心肌細胞總數(shù)，陽性率(%)=陽性心肌細胞總數(shù)/總心肌細胞數(shù)量×100%。本研究定義的心肌細胞是指細胞核外胞質(zhì)顯示清晰的橫紋，故在計算Brdu陽性率時，沒有細胞質(zhì)的增殖核不計算在內(nèi)[4-5]。

2 結(jié) 果

2.1大鼠急性心肌梗死模型建立 本實驗中14只大鼠，對照組5只全部存活，實驗組9只大鼠存活6只，存活率為67%。

2.2病理學檢查結(jié)果 常規(guī)蘇木精-伊紅染色片，對照組大鼠心肌細胞橫紋清晰，纖維結(jié)構(gòu)清楚，無炎性細胞浸潤(圖1A)。實驗組梗死心肌組織在顯微鏡下可見，區(qū)域性變性壞死，病變區(qū)肌纖維排列紊亂，肌絲斷裂溶解，細胞核固縮甚至碎裂，有炎性細胞浸潤(圖1B)。

2.3急性心肌梗死后Brdu陽性心肌細胞檢測 免疫組織化學檢查結(jié)果顯示：心肌組織中，Brdu標記的DNA分布于細胞核中，呈黃褐色深染。對照組未見Brdu陽性細胞(圖1C)；實驗組大鼠急性心肌梗死后左心室梗死邊緣區(qū)及右心室非梗死區(qū)均可見Brdu陽性細胞，即存在心肌細胞復制增殖(圖1D)。

實驗組左心室梗死邊緣區(qū)Brdu陽性心肌細胞比例對照組的5.7倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；右心室非梗死區(qū)Brdu陽性細胞比例為對照組的4.2倍(P<0.01)(表1)。

表1 大鼠心肌梗死后心肌細胞增殖情況 (%)

實驗組：采用開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支制作急性心肌梗死模型；對照組：開胸置縫線而不結(jié)扎

圖1A 對照組心肌組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果(×400) 圖1B 實驗組心肌梗死后心肌組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果(×400)

圖1C 對照組免疫組織化學法結(jié)果(×400) 圖1D 實驗組心肌梗死后免疫組織化學法結(jié)果(×400)

圖1對照組與實驗組大鼠心肌組織蘇木精-伊紅及Brdu免疫組織化學法染色結(jié)果

3 討 論

本實驗以大鼠為研究對象，采用Brdu注射標記法觀察心肌梗死后心肌細胞增殖再生。Brdu可在DNA合成期(S期)代替胸腺嘧啶，當細胞處于S期而同時又有BrdU存在時,就會有Brdu摻入新合成的DNA中，只要細胞不消亡，這種BrdU就在胞核的DNA中長時間存留，故用Brdu標記法檢測細胞增殖更為直觀直接，也易于檢測。

本實驗觀察到在損傷狀態(tài)下大鼠心肌細胞存在增殖,即DNA復制的現(xiàn)象，且僅開胸心肌置縫線的對照組大鼠心臟中也可見心肌細胞增殖。在大鼠急性心肌梗死心臟中，Brdu陽性心肌細胞數(shù)量較對照組明顯增多，說明心肌缺血可誘發(fā)心肌細胞再生，使其復制更為活躍。本研究還發(fā)現(xiàn)大鼠心肌梗死后心臟的左心室梗死邊緣區(qū)及右心室非梗死區(qū)均存在心肌細胞的增殖活動，提示急性缺血損傷后心肌細胞增殖再生是全心臟的，這可能與這些部位維持著有較充足的血氧供應(yīng)有關(guān)。

心肌缺血損傷后心肌細胞代償性的增殖再生，可在一定程度上補充壞死和凋亡所致的心肌細胞數(shù)量的減少，修復部分心臟功能，但由于新生的心肌細胞數(shù)量有限，尚不能真正意義上修復和改善梗死后心臟功能。這些新生的心肌細胞能否與原有的心肌有效工作細胞融合，真正意義上改善心臟功能，有待于進一步的研究證實[6-8]。

綜上所述，急性心肌缺血心肌損傷可誘發(fā)心肌細胞增殖再生，在一定程度上改善心臟功能，但此增殖作用有限。目前有關(guān)心肌梗死后心肌細胞發(fā)生增殖再生的來源及意義尚不十分清楚，有待于更深入的研究。

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